李科， 張琳， 劉福亮， 賈艷琨

(自然資源部地下水科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 中國地質(zhì)科學(xué)院水文地質(zhì)環(huán)境地質(zhì)研究所，河北 正定 050803)

碳、氮元素作為生物生存必須的元素，是組成生態(tài)系統(tǒng)的骨架。天然體中存在著大量碳、氮元素及其化合物，隨著物理和化學(xué)作用等天然條件的改變，引起它們的同位素比微量改變即同位素分餾，這種微量變化是認(rèn)識天然體中物質(zhì)變化的最好信息。穩(wěn)定碳同位素廣泛應(yīng)用于探討各種生態(tài)環(huán)境中的物質(zhì)來源和遷移規(guī)律[1-3]，氮同位素則反映了不同物源的貢獻(xiàn)[4-5]，作為生態(tài)環(huán)境研究的示蹤劑，碳、氮同位素可以提供非常重要的信息及人類活動記錄，在水中顆粒物、污泥、海洋沉積物、植物、土壤、第四紀(jì)等領(lǐng)域的研究愈加廣泛[6-12]。碳、氮穩(wěn)定同位素的分析已越來越廣泛地用于同位素化學(xué)、生物化學(xué)、環(huán)境科學(xué)、地球化學(xué)、礦物學(xué)和宇宙化學(xué)等[13-17]。

碳、氮同位素國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)由國際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)研制并向世界范圍內(nèi)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室發(fā)放，因其制備數(shù)量有限，幾種主要碳氮同位素國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)現(xiàn)已耗盡，IAEA倡導(dǎo)各國研制與國際標(biāo)準(zhǔn)相聯(lián)系的自己國家的同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國、日本[18]等很多國家都研制了與國際標(biāo)準(zhǔn)VPDB和Air-N2相聯(lián)系的碳、氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，滿足本國科研需求。在我國有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，20世紀(jì)80年代末期由中國石油勘探開發(fā)科學(xué)研究院研制了炭黑國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW04407、GBW04408)，用于有機(jī)質(zhì)碳同位素的測定。炭黑由近乎100%純碳組成，更適用于石油等領(lǐng)域高碳含量樣品測試。而環(huán)境中復(fù)雜成分的有機(jī)物質(zhì)，由于其碳含量(如土壤、沉積物等樣品)相對較低，之前的國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)不能滿足當(dāng)前各實(shí)驗(yàn)室生態(tài)環(huán)境樣品研究需求。隨著實(shí)驗(yàn)儀器的發(fā)展進(jìn)步，碳、氮同位素可以同時檢出，而我國尚無氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，研制與國際標(biāo)準(zhǔn)VPDB和Air-N2相聯(lián)系的碳、氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成為我國同位素技術(shù)應(yīng)用工作所面臨的一項(xiàng)緊迫任務(wù)。

國際上新近開展的同位素標(biāo)準(zhǔn)研制工作，皆使同位素組成形成系列，且差別更小，以提高量值傳遞精度。根據(jù)國際同位素研究學(xué)科發(fā)展趨勢和有機(jī)質(zhì)碳氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究現(xiàn)狀，本項(xiàng)目組按照我國環(huán)境樣品中碳氮穩(wěn)定同位素含量范圍[6-8]，完成了涵蓋我國天然環(huán)境碳氮穩(wěn)定同位素端值的呈梯度分布的4個有機(jī)質(zhì)碳、氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用目前國際廣泛應(yīng)用的高溫燃燒-氣體同位素質(zhì)譜法在線連續(xù)流分析技術(shù)[19-21]，開展均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)及定值，以適應(yīng)新方法新技術(shù)的需求，滿足不同環(huán)境樣品碳、氮穩(wěn)定同位素分析研究需求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 候選物的采集和制備

本次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與國際標(biāo)準(zhǔn)相聯(lián)系，所選的候選物包括了物理性質(zhì)不同的易溶于水的尿素和微溶于水的L-谷氨酸，兩種有機(jī)物在室溫條件下非常穩(wěn)定。選擇的有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定、均勻，有足夠量，能夠保證長期保存，兩種有機(jī)物C與N摩爾比不同，可滿足不同生態(tài)樣品分析需求。

根據(jù)生態(tài)系統(tǒng)中碳、氮同位素值組成的區(qū)間值δ13C值為-40‰～0‰，δ15N值為-10‰～30‰，確定了本項(xiàng)目研制的系列碳氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)同位素值區(qū)間。通過對大量商用試劑候選物的測試，篩選出處于δ13C、δ15N負(fù)端值的尿素、L-谷氨酸商用分析純作為2個候選物(表1)，通過添加高富集的δ13C、δ15N尿素純品，人工配制另兩種尿素，由此組成呈梯度分布、滿足不同特征值需求的系列(4個)有機(jī)物同位素標(biāo)準(zhǔn)品。

表1 碳氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物設(shè)計(jì)Table 1 Design of candidates for carbon and nitrogen isotopes reference materials

1.2 候選物分裝

在分裝標(biāo)準(zhǔn)前對小瓶進(jìn)行洗滌(酸洗、水洗)，烘干，滅菌。在盡可能短的時間內(nèi)將樣品分裝于潔凈的小玻璃瓶中，每瓶裝1g，每種標(biāo)準(zhǔn)樣品分裝1000瓶，從001～1000逐瓶編號。封口后全部樣品放置在裝有硅膠的干燥器中保存，干燥器放置于避光處長期保存。

2 候選物均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.1 候選物均勻性檢驗(yàn)

每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)隨機(jī)抽取25瓶的均勻性子樣，包括子樣中最可能產(chǎn)生污染的分裝過程的前5瓶，然后再隨機(jī)抽取子樣20瓶，每份子樣做雙份分析。δ13C、δ15N值選擇經(jīng)典的高溫燃燒-氣體同位素質(zhì)譜法進(jìn)行樣品的均勻性檢驗(yàn)，按照《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》(JJF 1343—2012)對測試結(jié)果進(jìn)行方差(單因素F檢驗(yàn)法)檢驗(yàn)，4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)得到的F值都小于相應(yīng)的自由度的臨界值，測試結(jié)果(表2)顯示4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物的均勻性良好。

表2 候選物δ13C和δ15N值的均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 2 Variance analysis for δ13C and δ15N values homogeneity inspection of reference materials

2.2 候選物穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性包括短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。為了獲得具有良好穩(wěn)定性的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，本次研制的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的初始階段注意選擇了具有穩(wěn)定性能材料作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的候選物[22-23]，《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》(JJF 1343—2012)中5.1短期穩(wěn)定性評估通常在不同溫度條件下進(jìn)行，以考察溫度對于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)待定特性值的影響，此次選擇將4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在不同溫度(4℃、20℃、35℃、50℃、60℃)下，進(jìn)行樣品δ13C和δ15N測定。經(jīng)檢驗(yàn)，環(huán)境溫度對δ13C和δ15N值無影響，因此本次研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在溫度、運(yùn)輸過程中的短期穩(wěn)定性。

4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)依據(jù)JJF 1343—2012中5.2要求，進(jìn)行了長期穩(wěn)定性的研究。在本項(xiàng)目實(shí)施的近兩年過程中，結(jié)合定值采用高溫燃燒-氣體同位素質(zhì)譜法進(jìn)行了5次δ13C和δ15N穩(wěn)定性檢驗(yàn)，由穩(wěn)定性測試結(jié)果(表3)表明，本項(xiàng)目研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物是穩(wěn)定的。

表3 候選物δ13C和δ15N值的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of for δ13C and δ15N values stability inspection of standard materials

3 特征量值分析及定值

3.1 定值溯源性

本次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的定值，采用多個實(shí)驗(yàn)室采用一種或多種準(zhǔn)確、可靠的方法協(xié)作測定，強(qiáng)調(diào)每個環(huán)節(jié)的量值溯源性，并且利用一切技術(shù)手段及組織手段確保分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和可靠性。測量δ13C值時，以國際標(biāo)準(zhǔn)IAEA-CH-6、USGS40、USGS41、L-SVEC為測量尺度。測量δ15N值時，以國際標(biāo)準(zhǔn)USGS40、IAEA-N-1、IAEA-N-2、USGS41為測量尺度，采用線性校正[24-26]所定出的δ值就是相對于國際標(biāo)準(zhǔn)VPDB和Air-N2的值。

3.2 定值實(shí)驗(yàn)室

經(jīng)過對行業(yè)代表性、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力及設(shè)備條件等進(jìn)行綜合考慮，本次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，經(jīng)過前期的盲樣考核后確定了包括研制單位實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)的12家實(shí)驗(yàn)室分別參與協(xié)同定值，參加協(xié)同定值的實(shí)驗(yàn)室為(實(shí)驗(yàn)室編號依次為1～12)：加拿大渥太華大學(xué)穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室(University of Ottawa G.G.Hatch Stable Isotope Laboratory)，中國科學(xué)院地質(zhì)與地球物理研究所，河海大學(xué)，國家海洋局杭州海洋二所，國家海洋局杭州海洋三所，中國地質(zhì)科學(xué)院青島海洋地質(zhì)研究所，中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，英國Iso-Analytical同位素分析研究中心(Iso-Analytical Stable Isotope Ratio Analysis Laboratory)，英國蘇格蘭大學(xué)(Scottish Universities Environmental Research Centre)，中國地質(zhì)調(diào)查局南京地質(zhì)調(diào)查中心，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所。

3.3 定值元素δ13C的測量方法及結(jié)果

本次δ13C值的定值測定是以經(jīng)典的高溫燃燒-氣體同位素質(zhì)譜法進(jìn)行測試，各實(shí)驗(yàn)室的測試儀器不同。根據(jù)Reference materials—General and statistical principles for certification(ISO Guide 35)和《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》(JJF 1343—2012)規(guī)定，δ13C定值實(shí)驗(yàn)組數(shù)為10組(表4)。

表4 各實(shí)驗(yàn)室δ13C值的分析方法和分析數(shù)據(jù)Table 4 Multiple measurement data of δ13C for the four reference materials

3.4 定值元素δ15N值的測量方法及結(jié)果

本次δ15N值的定值是采用經(jīng)典的高溫燃燒-氣體同位素質(zhì)譜法進(jìn)行測試，各實(shí)驗(yàn)室的測試儀器不同。根據(jù) ISO Guide 35和JJF 1343—2012規(guī)定，δ15N定值實(shí)驗(yàn)組數(shù)為12組(表5)。

表5 各實(shí)驗(yàn)室δ15N值的分析方法和分析數(shù)據(jù)Table 5 Multiple measurement data of δ15N for the four reference materials

3.5 數(shù)據(jù)處理

本次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以組均值為基礎(chǔ)，整理各協(xié)作實(shí)驗(yàn)室報(bào)出的數(shù)據(jù)，按標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)據(jù)處理的模式[27-32]：①分別采用狄克遜法(Dixon)和格拉布斯法(Grubbs)同時進(jìn)行離群值檢驗(yàn)，兩種方法檢驗(yàn)均為離群值則予以剔除；②采用夏皮羅-威爾克法(Shapiro-Wilk)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)正態(tài)性；③采用科克倫法(Cochran)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)之間是否等精度。經(jīng)檢驗(yàn)研制的4個碳氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)正態(tài)檢驗(yàn)值W均大于置信概率95%的列表值，剔除后的定值測試數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。

3.6 不確定度計(jì)算與評估

《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》(JJF 1343—2012)明確了標(biāo)準(zhǔn)值的總不確定度由三部分組成。第一部分是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程帶來的不確定度uchar，包括：①定值數(shù)據(jù)平均值的不確定度uA，由定值實(shí)驗(yàn)室間的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算得出；②對測量的其他一些影響因素作出分析估算出其大小uB。第二部分是物質(zhì)的不均勻性引起的不確定性估計(jì)ubb；第三部分是物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動性所引起的誤差uS；這三部分不確定度的合成不確定度為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總不確定度。現(xiàn)簡要分析如下。

(1)分析測量的引起的A類不確定度和B類不確定度

本次標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由多個實(shí)驗(yàn)室使用一種準(zhǔn)確可靠的方法協(xié)同進(jìn)行定值。測量數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)分析得出各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布。因此以算術(shù)平均值作為最佳估計(jì)值(標(biāo)準(zhǔn)值)；A類不確定度為平均值的不確定度，以各實(shí)驗(yàn)室定值數(shù)據(jù)平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測量次數(shù)及95%的置信水平算得，作為第一部分不確定度的估算值(包含了樣品分餾、測量全過程的誤差)。按照算術(shù)平均值的不確定度公式(1)進(jìn)行計(jì)算：

(1)

式中：s—實(shí)驗(yàn)室平均值數(shù)據(jù)間的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n—實(shí)驗(yàn)室平均值數(shù)據(jù)個數(shù)。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度B類評定是通過借助可利用的相關(guān)信息，進(jìn)行科學(xué)分析判斷而得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差，經(jīng)分析判斷得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差，得出不確定度的B類判定分量。本次定值過程中樣品和國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均使用相同原理方法及儀器進(jìn)行測量，樣品通過線性校正得到定值結(jié)果。本次B類不確度來源主要來自兩方面：由國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)本身不確定度引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合中數(shù)據(jù)對非線性的不確定度。

(2)不均勻性引起的不確定度

前已述及，通過均勻性檢驗(yàn)證明4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好，這里應(yīng)用ISO35導(dǎo)則中數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)一步對不均勻性引起的不確定度進(jìn)行分析。樣品組間不均勻性引起的標(biāo)準(zhǔn)偏差為MSamong，組內(nèi)不均勻性引起的標(biāo)準(zhǔn)偏差為MSwithin，樣品不均勻性引起的不確定度(uhom)由公式(2)進(jìn)行計(jì)算。

(2)

(3)不穩(wěn)定性引起的不確定度

4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特征量值穩(wěn)定性數(shù)據(jù)中無可觀察到的趨勢。按照導(dǎo)則ISO35中8.5方法，選擇了通過斜率為零的回歸直線的不確定度估計(jì)穩(wěn)定性的不確定度ults，在給定的時間t內(nèi)沒有顯著降解的情況下，采用公式(3)計(jì)算由于樣品不穩(wěn)定引起的不確定度：

ults=sb×t

(3)

(4)擴(kuò)展不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量的擴(kuò)展不確定度UCRM為定值測量不確定度uchar、均勻性引起的不確定度ubb、穩(wěn)定性引起的不確定度ults對特征值總不確定度的貢獻(xiàn)來計(jì)算，見公式(4)。當(dāng)對應(yīng)的置信水平為95%時，包含因子k=2，不確定度的修約是只進(jìn)不舍。最終的定值結(jié)果列于表6。

表6 定值元素δ13C和δ15N認(rèn)定值及擴(kuò)展不確定度Table 6 δ13C and δ15N ceritified values for materials GBW04494 to GBW04497 and their associated expanded uncertainties (k=2)

(4)

4 結(jié)論

本文報(bào)道了獲批的有機(jī)質(zhì)碳氮同位素國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW04494～GBW04497)研制過程。本次研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是基于研制單位多年實(shí)驗(yàn)積累的數(shù)據(jù)和天然環(huán)境樣品中碳、氮同位素含量組成，參照國際已研制的穩(wěn)定碳氮同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，研制完成的呈梯度分布、認(rèn)定值區(qū)間范圍大的系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其δ13C值為-45.60‰～2.16‰，δ15N值為-7.51‰～33.75‰，δ13C的定值擴(kuò)展不確定度≤0.08‰，δ15N的定值擴(kuò)展不確定度≤0.09‰，定值水平與國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相當(dāng)。

該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已供地質(zhì)及環(huán)境部門分析監(jiān)控、儀器校準(zhǔn)、方法評價、質(zhì)量保證和質(zhì)量監(jiān)控，為我國多家實(shí)驗(yàn)室提供了測試溯源保障，為地質(zhì)調(diào)查工作提供了技術(shù)支撐。同時該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)推動了同位素水文、環(huán)境學(xué)等相關(guān)學(xué)科研究工作的進(jìn)展，也為本項(xiàng)目組后期進(jìn)行其他穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制積累了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。