齊志文， 周 昊， 陳虹霞， 張昌偉， 鄧 濤， 王成章*

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室；國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點實驗室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室；江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210042；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 熱帶醫(yī)學(xué)研究所，廣東 廣州 510405)

抗腫瘤藥物紫杉醇水溶性差且生物利用度較低，難以穿透生物屏障到達靶器官或組織[1]，如何將紫杉醇精準(zhǔn)地運送到腫瘤部位一直是亟待解決的問題。人體正常組織的pH值為7.4，腫瘤組織由于乳酸的厭氧代謝，pH值為4～5[2]，因此，研究pH敏感型的載藥膠束對紫杉醇用于抗腫瘤治療非常有利。典型的具有pH響應(yīng)性的載藥膠束由兩親分子經(jīng)自組裝形成，粒徑為10～200 nm，表面電勢絕對值小于50 mV，進一步通過實體瘤的高滲透長滯留效應(yīng)(EPR)，可以使pH敏感的膠束選擇性地富集在腫瘤組織周圍[3]。漆酚能夠調(diào)節(jié)DNA的合成[4]，與紫杉醇聯(lián)用顯示出優(yōu)異的協(xié)同抑制腫瘤細胞HepG2增殖活性[5]。同時，漆酚硼酸酯衍生物具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性[5]，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的十二(四)胺，作為載藥膠束的疏水單元[6]。而在硼酸鹽分子中引入氮原子可以提高硼酸酯鍵的水解穩(wěn)定性[7]。此外，糖基化修飾的膠束易被腫瘤細胞HepG2的糖蛋白受體(ASGPR)識別，并在體內(nèi)具有更高的生物利用度[8]。本研究通過小分子化學(xué)合成及聚合物自組裝技術(shù)，制備了漆酚基pH響應(yīng)型膠束BPAU-NH2，以及加入識別單元半乳糖(Gal)的pH響應(yīng)型膠束BPAU-NH2-Gal，經(jīng)透析法包埋紫杉醇，表征了其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并測試了其形貌、粒徑、電位等；進一步通過體外載藥和釋藥實驗，考察了漆酚基膠束對人體正常肝細胞LO2的毒性，以及人肝癌細胞HepG2對膠束的攝入活性，以期開發(fā)一種生物相容性高、穩(wěn)定性好的漆酚基pH響應(yīng)型載藥膠束，為漆酚基靶向載藥膠束材料的開發(fā)與應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 原料、試劑與儀器

紫杉醇(PTX)，南京源葉生物公司；半乳糖胺(99%)；N，N′-羰基二咪唑(CDI)、氨基官能化甲氧基聚乙二醇(mPEG-NH2，Mn為5 000)、5-氨基-1-戊醇、1,3-二氨基戊烷、1,4-丁二醇二丙烯酸酯(BUDA)，均購于上海阿拉丁試劑公司；香豆素，中國國藥控股有限公司；Hoechst 33342染料，德國Hoechst股份有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、人體正常肝細胞LO2及人肝癌細胞HepG2，南京凱基生物有限公司；其他試劑均為分析純。

7890A高效液相色譜儀，Thermo C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為V(甲醇) ∶V(水) ∶V(乙腈)=24 ∶39 ∶37，檢測波長227 nm，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進樣體積10 μL，透析袋(8 000 u)，美國安捷倫公司；Zeta電位儀，英國馬爾文公司；Sigma 703D型表/界面張力儀，瑞典Biolin公司；1515/2414型凝膠色譜(GPC)儀，美國Waters公司；ZS90型激光粒度儀，英國Malvern公司；JEM-2100F型透射電鏡，日本Jeol公司；AVANCE II 400 MHz核磁共振波譜儀，德國布魯克公司。

1.2. 載藥膠束材料的自組裝

1.2.1合成路徑 pH響應(yīng)型膠束BPAU-NH2的合成路徑如圖1所示。

圖1 pH響應(yīng)型膠束BPAU-NH2的合成路徑

1.2.2BPAU的合成 稱取mPEG-NH2(0.08 mmol)，5-氨基-1-戊醇(0.3 mmol)和BUDA(1.2 mmol)溶解于DMSO中，常溫反應(yīng)36 h。隨后，加入過量的1，3-二氨基戊烷(1.4 mmol)與體系中過量的BUDA在60 ℃下連續(xù)反應(yīng)24 h，產(chǎn)物凍干得到白色粉末樣品，不經(jīng)處理，直接參與下一步反應(yīng)。

1.2.3BPAU-NH2的合成 將課題組前期[5]合成的副產(chǎn)物三烯漆酚馬來酸酐苯硼酸胺(URU-NH2，0.08 mmol)和BPAU(1.2 mmol)溶解于2 mL DMSO中，60℃條件下攪拌反應(yīng)24 h。添加1，3-二氨基戊烷(1.4 mmol)消耗過量的BUDA，以20 mL CH2Cl2作稀釋劑，60 ℃繼續(xù)攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，用去離子水將液體洗滌2次，以除去過量的1，3-二氨基戊烷，有機層用無水MgSO4過夜干燥。除去MgSO4后，凍干得到BPAU-NH2膠束產(chǎn)品。

1.2.4BPAU-NH2-Gal的合成 將半乳糖胺(1.0 mmol)、BPAU-NH2(1.0 mmol)和CDI(1.2 mmol)溶于10 mL乙腈中，回流反應(yīng)1 h。緩慢滴加三乙胺(TEA)(1.2 mmol)，繼續(xù)回流反應(yīng)10 h。反應(yīng)結(jié)束后，大量水洗滌，乙酸乙酯萃取，濃縮蒸干得到膠束粗品。然后將膠束粗品置于透析袋(8 000 u)中，經(jīng)H2O-H3PO4溶液(體積比100 ∶0.5，2 L)透析，透析液凍干得到BPAU-NH2-Gal膠束產(chǎn)品。

1.3 膠束對紫杉醇的負載和釋放

1.3.1 紫杉醇載藥膠束的制備 應(yīng)用透析技術(shù)制備紫杉醇載藥膠束。將BPAU-NH2-Gal膠束粉末(20.0 mg)和PTX(4.0 mg)溶于3.0 mL pH值7.4的PBS溶液中，室溫超聲波處理24 h，倒入透析袋(8 000 u)內(nèi)，用5 L去離子水透析24 h，低溫冷凍干燥即可得漆酚基紫杉醇載藥膠束PTX@BPAU-NH2-Gal粉末。

1.3.2 膠束對紫杉醇包封率和載藥量的測定 采用HPLC測定膠束的載藥量和包封率[9]。因紫杉醇難溶于水，未包封的紫杉醇大多會以游離微晶形式存在，濾膜可截留[10]。稱取一定質(zhì)量的PTX@BPAU-NH2-Gal膠束粉末，用純凈水溶解，過0.22 μm濾膜，用甲醇定容，超聲波破碎載藥膠束，釋放膠束包載的全部藥物。根據(jù)HPLC在227 nm波長處的峰面積，定量計算膠束包埋PTX的總藥量。載藥量和包封率的計算公式如下：

載藥量=載入膠束中紫杉醇的質(zhì)量/膠束的總質(zhì)量×100%

包封率=載入膠束中紫杉醇的質(zhì)量/紫杉醇的總投入量×100%

1.3.3 紫杉醇體外釋放機制的考察 按照文獻[10]方法，取適量的紫杉醇載藥膠束溶液于處理過的透析袋(8 000 u)內(nèi)。將透析袋置于含0.2%PBS-聚山梨酯80的釋放介質(zhì)中，在室溫攪拌(200 r/min)條件下于pH值分別為4.5、 6.8、 7.4的溶液中進行釋放實驗，分別于1、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 24、 34、 44、 65和90 h時，取出微量釋放介質(zhì)經(jīng)0.22 μm微孔水系濾膜過濾，HPLC法測定PTX含量。

1.4 分析與表征

1.4.1膠束平均相對分子質(zhì)量的測定 以四氫呋喃(THF)為溶劑，配置1 g/L的膠束溶液備用。采用ShodexOHpack SB-803 HQ凝膠色譜柱，聚苯乙烯(平均重均相對分子質(zhì)量為2 000)作為標(biāo)樣，THF作為流動相(流速為1 mL/min，25 ℃)，測定膠束的相對分子質(zhì)量。

1.4.2臨界膠束濃度(CMC)測定 用表面張力(γ)-濃度(c)關(guān)系作圖，當(dāng)表面吸附達到飽和時，曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折點，該點的濃度即為臨界膠束濃度。通過全自動Biolin表面張力儀的臨界膠束濃度(CMC)測量模式，自動測定膠束不同濃度時的表面張力，同時記錄γ-c曲線，通過擬合曲線，自動判別拐點并計算出該體系中膠束的CMC值。

1.4.3膠束粒徑、Zeta電位的測定 配置1 g/L的膠束去離子水溶液，置于樣品池中，采用Zeta電位移測定電位，用激光粒度儀進行粒徑分布分析(He-Ne激光，λ為633 nm；散射角為90°)。

1.4.4膠束形貌分析 配置0.1 g/L的膠束去離子水溶液，滴加于銅網(wǎng)上自然風(fēng)干，透射電鏡(電壓200 kV，電子束電流為102 μA)下觀察膠束形貌。

1.4.5膠束對LO2細胞的毒性 采用噻唑藍(MTT)法測試載藥膠束對LO2細胞的毒性。將對數(shù)生長期的細胞按3.5×103個/孔接種于0.2 mL/孔的96孔培養(yǎng)板中，用不同濃度的載藥膠束樣品孵育72 h。然后，加入10 μL的 5 g/L工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，按150 μL/孔加入DMSO，使結(jié)晶充分溶解。用微板閱讀器測定波長490 nm處的吸光度(A)。計算細胞存活率(η) ∶η=(1-A實驗組/A空白對照組)×100%。

1.4.6膠束對HepG2細胞攝取的熒光強度測試 在pH值為4.5和6.8條件下，分別用包埋少量香豆素(0.01 g/L)的質(zhì)量濃度為10 g/L的3種載藥膠束PTX@BPAU、PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal溶液孵育HepG2細胞，Hoechst 33342(0.01g/L)侵染細胞核，培養(yǎng)2 h。PBS洗滌3次后，置于共聚焦激光掃描顯微鏡下觀察拍照。香豆素作為檢測指標(biāo)，所有的觀察過程均使用相同的曝光時間、亮度和對比度，通過Image-Pro Plus軟件分析熒光強度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠束的結(jié)構(gòu)表征

采用1H NMR和13C NMR分析聚合物膠束BPAU和BPAU-NH2的結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖2和圖3。

圖2 膠束的1H NMR圖

BPAU-NH2-Gal：棕色粉末，1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ： 4.45～4.00(Gal-OH),3.25(Gal-NH—)。13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ： 97.63～72.9(Gal-C)。

2.2 載藥膠束的性質(zhì)及形貌分析

膠束GPC測試結(jié)果表明：BPAU-NH2-Gal膠束的平均重均相對分子質(zhì)量(Mw)約為15 550，數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)約為10 435，分散性指數(shù)(PDI)為1.49，表明膠束的聚合物質(zhì)量分布較為均勻。此外，測得BPAU-NH2-Gal的臨界膠束濃度(CMC)值為90.29 mg/L，表明膠束在溶液中的穩(wěn)定性較好，有利于膠束參與人體循環(huán)[3]。BPAU-NH2-Gal的平均粒徑及Zeta電位分別為195.5 nm和29.7 mV，其載藥膠束PTX@BPAU-NH2-Gal的Zeta電位為30 mV，載藥膠束帶正電表明膠束容易吸附到帶負電的血漿白蛋白上，有利于膠束在血液循環(huán)中穩(wěn)定性的提高和循環(huán)時間的延長。此外，膠束表面的親水羧基可以識別網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，有利于膠束實現(xiàn)被動靶向[11]。

同時，由膠束的形貌(圖4)可以觀察到PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal膠束的微觀形貌呈橢圓形不規(guī)則結(jié)構(gòu)，顆粒大小較均勻。

PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal的粒徑分布如圖5所示，其平均粒徑大小分別約為135和195 nm，粒徑小于200 nm表明兩者可通過EPR效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤的被動靶向，并使藥物在腫瘤部位積聚；且膠束粒徑大于腎清除閾值，可減少腎對膠束的快速清除[12]。PTX@BPAU-NH2-Gal膠束的平均粒徑比PTX@BPAU-NH2膠束稍大，可包埋更多紫杉醇。

2.3 膠束安全性及載藥和釋藥性能

膠束對正常細胞LO2的毒性數(shù)據(jù)見表1，PTX@BPAU-NH2-Gal膠束質(zhì)量濃度為200 mg/L時，LO2細胞存活率仍大于93%，表明膠束對人正常肝細胞LO2毒性較低，具有較好的生物相容性。此外，HPLC法測得PTX@BPAU-NH2-Gal膠束對紫杉醇的包封率和載藥量分別為92.51%和31.76%；PTX@BPAU-NH2膠束對紫杉醇的包封率和載藥量分別為90.68%和30.12%。膠束PTX@BPAU-NH2-Gal中存在漆酚側(cè)鏈脂肪烴，疏水性能較強，導(dǎo)致膠束疏水內(nèi)核較大，從而提高了膠束的載藥量。

表1 膠束對人正常細胞LO2毒性Table 1 Micelles toxicity on human normal cells LO2

圖6 載藥膠束PTX@BPAU-NH2-Gal的釋藥性能Fig.6 Drug release performance of drug-loaded micelle PTX@BPAU-NH2-Gal

由圖6可知，載藥膠束的釋藥性能呈現(xiàn)pH響應(yīng)的特性，表現(xiàn)出在低pH值條件下快速釋放直至達到平衡釋放的特點。膠束pH值較低條件下釋藥較快的原因，可能是在低pH值下，胺基苯硼酸中酸性修飾基團—COOH發(fā)生質(zhì)子化作用，以及膠束中的叔胺基團在酸性條件下與質(zhì)子結(jié)合形成陽離子基團，引起聚合物鏈之間的靜電排斥效應(yīng)，使膠束增溶/膨脹，從而達到增大釋藥量的作用。如圖6所示PTX@BPAU-NH2-Gal載藥膠束在0.2%PBS-聚山梨酯80體系中，膠束的藥物1 h累積釋放率在pH值為 7.4 時約為2.35%，而在pH值為4.5時為4.56%；釋放8 h時，分別上升到5.8%和19.2%；24 h后，在pH值為7.4時僅為7.9%；在pH值為4.5時為37.64%。顯然，酸性條件(pH值為4.5)有助于加快紫杉醇的釋放，膠束的藥物釋放行為表現(xiàn)出強烈的pH依賴性。原因可能是PTX@BPAU-NH2-Gal膠束具有一定的pH響應(yīng)能力，在酸性介質(zhì)中發(fā)生質(zhì)子化，導(dǎo)致膠束膨脹，紫杉醇快速釋放[13-14]。同時，紫杉醇是一種弱堿性藥物，在酸性條件下具有更大的溶解度。因此，紫杉醇在酸性釋放介質(zhì)中擴散更快，導(dǎo)致藥物釋放更快[15]。

2.4 載藥膠束的細胞攝入性能

3種載藥膠束PTX@BPAU、PTX@BPAU-NH2和PTX@BPAU-NH2-Gal對應(yīng)HepG2細胞的熒光強度見圖7。

HepG2細胞熒光強度結(jié)果表明：在相同pH值條件下，HepG2細胞對3種載藥膠束的攝取具有明顯差異。3種膠束與HepG2細胞作用2 h時，在pH值4.5條件下香豆素對應(yīng)的熒光強度分別為42.57%、65.14%和99.99%；在pH值6.8條件下香豆素對應(yīng)的熒光強度分別為27.00%、31.06%和51.45%?？梢钥闯?，在pH值為4.5時，熒光強度明顯高于其在pH值為6.8的環(huán)境中，表明HepG2對3種膠束的攝取作用呈pH響應(yīng)型關(guān)系。此外，在相同pH值條件下HepG2細胞對3種載藥膠束的攝取具有明顯差異，其中HepG2細胞對PTX@BPAU-NH2-Gal載藥膠束的攝入能力最強，表明漆酚和半乳糖的引入可以提高HepG2細胞對膠束的攝取[6-7,16]。

3 結(jié) 論

3.1在傳統(tǒng)pH敏感型膠束BPAU的基礎(chǔ)上，以URU-NH2為疏水單元、半乳糖(Gal)為識別單元合成了漆酚基pH響應(yīng)型膠束BPAU-NH2-Gal，采用多種方法對其結(jié)構(gòu)進行了表征。結(jié)果表明：漆酚基pH響應(yīng)型膠束BPAU-NH2-Gal已經(jīng)成功合成，證明漆酚硼酸酯分子可以作為疏水單元應(yīng)用于膠束的制備；其Mw值約為15 550，PDI為1.49，CMC值約為90.29 mg/L，Zeta電位值為29.7 mV。

3.2以紫杉醇(PTX)為受試藥物，采用透析法制備了納米載藥膠束PTX@BPAU-NH2-Gal，該載藥膠束的外觀呈不規(guī)則橢圓結(jié)構(gòu)，平均粒徑為195 nm左右；對紫杉醇的包封率為92.51%，載藥量為31.76%，能夠有效運用于紫杉醇的靶向運輸。

3.3載藥膠束PTX@BPAU-NH2-Gal表現(xiàn)出明顯的pH響應(yīng)性，其藥物釋放量在pH值4.5時明顯高于其在pH值為6.8、7.4的環(huán)境；同時表現(xiàn)出對LO2細胞的低毒性，當(dāng)膠束質(zhì)量濃度為200 mg/L時，LO2細胞存活率仍大于93%。在pH值4.5條件下，HepG2細胞對該載藥膠束具有很強的攝入能力，表明漆酚和半乳糖的引入可以提高HepG2細胞對膠束的攝取。