侯鳴夷，殷 浩，賀學(xué)軍

(湖南省人民醫(yī)院骨5科，長沙 410016)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低、骨組織微觀結(jié)構(gòu)惡化而導(dǎo)致骨脆性增強(qiáng)為特征的代謝性骨骼疾病[1]，與年齡相關(guān)的骨折有關(guān)，已成為世界性的公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)[2]。骨代謝是一種涉及骨形成和骨吸收的終身過程，而骨質(zhì)疏松癥是骨吸收和形成的耦合不平衡的結(jié)果[3]。因此，增加骨形成和(或)減少骨吸收是抗骨質(zhì)疏松癥藥所必需的條件[4]。目前臨床常用抗骨質(zhì)疏松癥藥物(如雙膦酸鹽、地諾單抗、降鈣素、甲狀旁腺激素和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑等)存在頜骨壞死、低鈣血癥和腎功能損害等副作用[5]，因此，有必要繼續(xù)尋找與開發(fā)其他安全有效的抗骨質(zhì)疏松癥藥物。目前，中藥已被廣泛用于防治各種骨骼疾病[6]，故對(duì)中藥中具有增加骨形成和(或)減少骨吸收的天然活性化合物的篩選有助于發(fā)現(xiàn)新的高活性的抗骨質(zhì)疏松癥藥物。

胡椒堿是黑胡椒中的一種生物堿類的天然活性化合物，其具有包括降低胰島素抵抗、抗炎和促分化等廣泛的藥理活性[7]。據(jù)報(bào)道[8-9]，胡椒堿對(duì)濕疹、牛皮癬、糖尿病和癌癥等慢性疾病具有明顯的療效。胡椒堿刺激骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為成骨細(xì)胞并抑制向脂肪細(xì)胞的分化，然而，其具體的分子作用機(jī)制尚不完全清楚[10]。本研究觀察了胡椒堿對(duì)胎鼠顱骨成骨細(xì)胞成骨分化的影響，結(jié)果表明，胡椒堿可通過經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨分化，為治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路。

1 材料和方法

1.1 胎鼠顱骨成骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)

5只雌性Wistar大鼠的胎鼠(1日齡，體重5～6 g)購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(SCXK(湘)2016-0002)。按照文獻(xiàn)[11]的方法分離胎鼠顱骨成骨細(xì)胞。胎鼠顱骨成骨細(xì)胞分離的實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理與使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.20181216015)。胎鼠顱骨成骨細(xì)胞在10%胎牛血清(Gibco，美國)和1%青霉素-鏈霉素(上海碧云天生物公司)的高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)中培養(yǎng)，每3天換液1次，待細(xì)胞生長至第4—6代時(shí)收集細(xì)胞。第4—6代成骨細(xì)胞接種至補(bǔ)充有10 mmol·L-1β-甘油磷酸二鈉鹽水合物和50 μg·mL-1抗壞血酸的成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基(OBM)(Sigma-Aldrich，美國)。

1.2 細(xì)胞毒性測定

通過MTT法測定胡椒堿對(duì)成骨細(xì)胞的毒性。將顱骨成骨細(xì)胞以1×105個(gè)·孔-1接種于24孔培養(yǎng)板中，分別加入0、5、10、20、40、60、80 μmol·L-1胡椒堿一起溫育7 d。待各處理時(shí)間終點(diǎn)時(shí)，根據(jù)MTT試劑盒(Sigma-Aldrich，美國)說明書步驟，將細(xì)胞與MTT溶液一起溫育2 h，用DMSO溶解結(jié)晶后，用酶標(biāo)儀(ELx808，BioTek，美國)在550 nm的波長下測量吸光度。

1.3 堿性磷酸酶(ALP)活性測定

將成骨細(xì)胞以1×105個(gè)·孔-1接種于24孔培養(yǎng)板中，分別加入0、5、10、40 μmol·L-1胡椒堿一起溫育7 d。除去培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞3次。將細(xì)胞在冰上的0.1% Triton X-100緩沖液中裂解，并將樣品在4 ℃下以13 500 g離心15 min，收集上清液。按照ALP活性試劑盒(北京索萊寶公司)步驟，用對(duì)硝基苯基磷酸酯作為上清液的反應(yīng)底物，用酶標(biāo)儀(ELx808，BioTek，美國)在510 nm的波長下測量吸光度。并使用二辛可寧酸(BCA)蛋白質(zhì)測定試劑盒(上海碧云天生物公司)測定上清液的總蛋白質(zhì)含量。最后，通過蛋白濃度將ALP的活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 ALP和茜素紅S染色

將成骨細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板(5×103個(gè)·孔-1)中，分別加入0、5、10、40 μmol·L-1胡椒堿一起孵育，在第12天進(jìn)行ALP和茜素紅S染色。用PBS洗滌細(xì)胞3次，并在室溫下用4%多聚甲醛固定30 min。用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽/硝基藍(lán)四唑堿性磷酸酶顯色試劑盒(上海碧云天生物公司)進(jìn)行ALP染色。用0.5%茜素紅S溶液(pH4.2)(北京索萊寶公司)在室溫下進(jìn)行茜素紅S染色1 h。用數(shù)碼相機(jī)(Canon 600D，Canon，日本)捕獲染色細(xì)胞的圖像。為了量化礦化水平，將茜素紅S染色的細(xì)胞在室溫下溶于10%氯化十六烷基吡啶中1 h，隨后，將溶解的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到96孔板中，用酶標(biāo)儀(ELx808，BioTek，美國)測量560 nm處的吸光度。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)分析

將成骨細(xì)胞接種于6孔板(8×105個(gè)·孔-1)中，分別加入0、5、10、40 μmol·L-1胡椒堿一起孵育24 h。根據(jù)制造商的說明書，用TRIzol試劑(Invitrogen，美國)加入板中以提取細(xì)胞總RNA。使用Rever TraAce RT-qPCR試劑盒(Toyobo Life Science，日本)在37 ℃下將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Taq SYBR Green qPCR Premix(TaKaRa，日本)和ALP、I型膠原蛋白α1(COL1A1)、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子蛋白(OSX)、骨橋蛋白(OPN)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和內(nèi)部對(duì)照GAPDH的引物以及合成的cDNA在標(biāo)準(zhǔn)酶和循環(huán)條件下用LightCycler 480II實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Roche Applied Science，德國)進(jìn)行反應(yīng)。熱循環(huán)條件：94 ℃ 3 min，然后40個(gè)循環(huán)94 ℃ 15 s和64 ℃ 1 min。用2-ΔΔCq法計(jì)算目的基因mRNA表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將成骨細(xì)胞接種于48孔板(2×103個(gè)·孔-1)中，分別加入0、40 μmol·L-1胡椒堿一起孵育24 h。在室溫下用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min，用PBS洗滌細(xì)胞3次，并用0.3%Triton X-100透化30 min，用Immunol染色阻斷緩沖液(上海碧云天生物公司)在室溫下封閉1 h。將細(xì)胞與抗β-catenin抗體(1:500，Proteintech Group，美國)在4 ℃下孵育過夜，次日，將細(xì)胞與AlexaFluor 488-綴合的二抗(1:500，Proteintech Group，美國)在37 ℃溫育50 min，在室溫下用DAPI(上海碧云天生物公司)染核5 min。PBS洗滌3次，并使用激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)成像。

1.7 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)分析

將成骨細(xì)胞接種于6孔板(8×105個(gè)·孔-1)中，分別加入0、5、10、40 μmol·L-1胡椒堿一起孵育24 h后，用細(xì)胞裂解緩沖液(上海碧云天生物公司)裂解細(xì)胞并提取總蛋白質(zhì)。并通過BCA測定試劑盒(上海碧云天生物公司)定量總蛋白質(zhì)含量。用10%SDS-PAGE分離每樣品(30 μg)并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(0.45 μm孔徑)。將膜在封閉溶液(5%脫脂乳)中室溫下封閉1 h，并在4 ℃下分別與一抗β-catenin、Wnt1(1:1000，Proteintech Group，美國)和GAPDH抗體(1:8000，上海碧云天生物公司)孵育過夜。用TBST溶液洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG(1:2000，上海碧云天生物公司)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的ECL化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天生物公司)顯現(xiàn)條帶于膠片，并使用Image Pro Plus 6.0掃描條帶的密度值，并計(jì)算GAPDH條帶密度值標(biāo)準(zhǔn)化目的蛋白β-catenin和Wnt1的表達(dá)量。

1.8 Wnt/β-catenin通路驗(yàn)證

將成骨細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板(5×103個(gè)·孔-1)中，并用Wnt/β-catenin信號(hào)途徑的特異性拮抗劑IWR-1(0.1 μg·mL-1，MedChemExpres，美國)預(yù)處理1 h，然后分別與0、40 μmol·L-1胡椒堿一起孵育，在第12天進(jìn)行茜素紅S染色，茜素紅S染色和數(shù)據(jù)采集方法同“1.4”部分。將成骨細(xì)胞接種于6孔板(8×105個(gè)·孔-1)中，并用Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑的特異性拮抗劑IWR-1預(yù)處理1 h，然后分別與0、40 μmol·L-1胡椒堿一起孵育24 h后，用Western blot分析β-catenin相對(duì)表達(dá)，Western blot和數(shù)據(jù)采集方法同“1.7”部分。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胡椒堿促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化

MTT法測量結(jié)果顯示，胡椒堿0、5、10、20、40、60 μmol·L-1處理的成骨細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示0～60 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)胡椒堿對(duì)成骨細(xì)胞無毒性(圖1A)。ALP染色、茜素紅S染色結(jié)果顯示，在0～40 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，胡椒堿以劑量依賴性方式促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP染色(圖1B左)與茜素紅S染色(圖1C左)。與0 μmol·L-1胡椒堿處理組比較，10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組ALP活性、礦化水平均顯著增加[(212.4±4.4)%、(307.6±15.6)%比(104.3±5.5)%,P<0.01或P<0.001；(171.2±6.4)%、(272.7±5.1)%比(101.4±5.7)%,P<0.05或P<0.01](圖1B右、圖1C右)。

2.2 胡椒堿促進(jìn)成骨細(xì)胞分化基因的表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，胡椒堿以劑量依賴性方式促進(jìn)成骨細(xì)胞促成骨分化基因ALP、COL1A1、OSX、OPN、Runx2 mRNA表達(dá)水平。與0 μmol·L-1胡椒堿處理組比較，5、10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組ALP mRNA表達(dá)顯著增加[(162.3±4.9)%、(204.6±2.1)%、(286.5±5.4)比(98.7±4.5)%,P<0.05、P<0.01或P<0.001]；10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組COL1A1 mRNA表達(dá)顯著增加[(207.6±11.4)%、(234.9±18.4)%比(102.4±3.5)%,P<0.05或P<0.01]；5、10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組OSX mRNA表達(dá)顯著增加[(181.5±8.1)%、(206.8±3.5)%、324.6±4.9)%比(101.6±7.2)%,P<0.05、P<0.01或P<0.001]；10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組OPN mRNA表達(dá)顯著增加[(189.6±17.3)%、(304.4±21.6)%比(102.4±3.5)%,P<0.05或P<0.01]；5、10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組Runx2 mRNA表達(dá)顯著增加[(168.6±18.4)%、(215.4±5.6)%、(282.3±7.9)%比(102.1±4.3)%,P<0.05、P<0.01或P<0.001]。見圖2。

2.3 胡椒堿促進(jìn)成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性

Western blot檢測結(jié)果顯示，胡椒堿以劑量依賴性方式促進(jìn)Wnt 1和β-catenin蛋白的表達(dá)。與0 μmol·L-1胡椒堿處理組比較，5、10、40 μmol·L-1胡椒堿處理組Wnt 1、β-catenin蛋白表達(dá)顯著增加[(156.7±6.6)%、(202.4±3.1)%、(289.7±6.7)%比(103.4±4.8)%,(167.3±4.6)%、(213.5±2.8)%、(304.9±8.9)%比(106.3±5.4)%,均P<0.05、P<0.01或P<0.001]。免疫熒光染色結(jié)果顯示，β-catenin蛋白位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，并且在用40 μmol·L-1胡椒堿處理后，細(xì)胞核中的β-catenin水平顯著增加。見圖3。

2.4 胡椒堿通過Wnt/β-catenin信號(hào)途徑參與調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的成骨分化

Western blot檢測結(jié)果顯示，與40 μmol·L-1胡椒堿處理組比較，IWR-1預(yù)處理可顯著抑制由40 μmol·L-1胡椒堿誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的β-catenin的上調(diào)[(142.3±8.4)%比(334.7±7.6)%,P<0.01]。茜素紅S染色結(jié)果顯示，IWR-1預(yù)處理可顯著抑制由40 μmol·L-1胡椒堿誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞茜素紅S染色和礦化結(jié)節(jié)形成[(125.7±9.3)%比(326.8±8.1)%,P<0.01]。見圖4。

3 討論

隨著我國人們飲食習(xí)慣的變更和老齡化程度的加快，骨質(zhì)疏松癥患者日益增加[12]。而目前臨床常用的抗骨質(zhì)疏松癥藥物存在血液、肝腎功能損害和消化系統(tǒng)障礙等副作用[5]。中藥中的某些天然活性化合物具有促骨形成與鈣化、增加骨量和減少骨吸收的作用[13]，因此，對(duì)天然活性化合物的篩選有可能發(fā)現(xiàn)新的安全高效的抗骨質(zhì)疏松癥藥物。本研究結(jié)果顯示，胡椒堿具有促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化，提示胡椒堿可作為抗骨質(zhì)疏松癥的潛在藥物。

骨形成的主要特征是成骨細(xì)胞外基質(zhì)合成和基質(zhì)礦化[14]。ALP表達(dá)和活性在成骨分化的初始階段增加，且ALP活性增加能進(jìn)一步促進(jìn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的基質(zhì)礦化[15]。本實(shí)驗(yàn)通過ALP活性檢測、ALP染色和RT-qPCR評(píng)估胡椒堿對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性和表達(dá)的影響，證明了胡椒堿(在0～40 μmol·L-1范圍內(nèi))能劑量依賴性增強(qiáng)ALP的活性和表達(dá)。細(xì)胞外基質(zhì)礦化是構(gòu)成骨形成的主要部分，是反映細(xì)胞分化的功能性體外終點(diǎn)[15]。本研究進(jìn)一步采用茜素紅S染色評(píng)估了胡椒堿處理對(duì)基質(zhì)礦化的作用，發(fā)現(xiàn)胡椒堿(在0～40 μmol·L-1范圍內(nèi))能濃度依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成。成骨細(xì)胞數(shù)量減少與較低的骨形成率相關(guān)[16]。因此，通過MTT法評(píng)估胡椒堿對(duì)成骨細(xì)胞活力的影響，以確定胡椒堿是否影響成骨細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明，在0～60 μmol·L-1范圍內(nèi)，胡椒堿對(duì)成骨細(xì)胞無細(xì)胞毒性。說明胡椒堿在促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化過程中并未造成成骨細(xì)胞的數(shù)量變化。

Wnt/β-catenin信號(hào)途徑在成骨分化中起著重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，胡椒堿誘導(dǎo)β-catenin上調(diào)并可能促進(jìn)其在細(xì)胞核中的積累，這表明胡椒堿可以維持β-catenin的穩(wěn)定。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)途徑中的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)分子，并且當(dāng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)被激活時(shí)被上調(diào)[17]，細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的增加誘導(dǎo)β-catenin易位進(jìn)入細(xì)胞核，隨后與蛋白質(zhì)的淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子/轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合并調(diào)節(jié)Wnt的下游靶基因的表達(dá)。Runx2是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因[18]。Runx2和COL1A1在成骨分化的早期階段上調(diào)，能促進(jìn)骨基質(zhì)礦化相關(guān)基因的表達(dá)[18-19]。OSX位于Runx2的下游，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化和ALP活性[20]。成骨細(xì)胞早期階段能分泌OPN，且其能促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化[21]。本研究結(jié)果顯示胡椒堿能濃度依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP、COL1A1、OSX、OPN和Runx2基因的表達(dá)。

總之，胡椒堿可通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)成骨細(xì)胞的成骨分化。本實(shí)驗(yàn)證明了胡椒堿的作用機(jī)制，并可能為控制骨質(zhì)疏松癥提供潛在的治療藥物。