魏志萍，劉雅珺，楊樹(shù)龍

(1.河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院生理教研室，河南 安陽(yáng) 455000； 2.南昌大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理教研室,南昌 330006)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性的、系統(tǒng)性的，以滑膜炎為主要表現(xiàn)的自身免疫疾病[1]。成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)異常增殖在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病過(guò)程(滑膜細(xì)胞增生，血管翳的形成及軟骨和骨組織的破壞等)中起著至關(guān)重要的作用，但其在發(fā)病過(guò)程中的分子機(jī)制仍尚未明確[2]。有研究[3]表明RA患者滑膜組織中環(huán)氧合酶(COX)表達(dá)明顯增加，表明COX在RA的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。因此，可以通過(guò)抑制COX的表達(dá)，達(dá)到減輕癥狀治療RA的效果。

薯蕷皂苷(Dio)為中國(guó)傳統(tǒng)中藥的常用藥材，具有活血舒筋、消食利水、祛痰、截瘧的功效，現(xiàn)代研究[4]證實(shí)其具有抗炎、抗腫瘤、改善心血管功能、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用。目前薯蕷皂苷治療RA的研究較少，而其對(duì)FLS作用的研究更是鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討薯蕷皂苷對(duì)腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的CIA大鼠成纖維樣滑膜(FLS)細(xì)胞環(huán)氧合酶1(COX1)、環(huán)氧合酶2(COX2)表達(dá)的影響，為薯蕷皂苷治療RA提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

CIA大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞株(上海研生實(shí)業(yè)有限公司)，薯蕷皂苷(南京春秋生物公司)，TNF-α(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(Solarbio公司)，胎牛血清(杭州四季青生物公司)，0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，GoTaq qPCR Master Mix(Promega公司)，兔抗5-LO(Santa Cruz公司)，兔抗LTA4H(Santa Cruz公司)，兔抗GAPDH(Origene公司)，TRIzol(Takara公司)，GoScriptTM Reverse Transcription System(Promega公司)。ABI7500熒光定量PCR儀(Appleid Biosystems公司)，SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)，GAS 7301B凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，PCR儀(MJ Resdarch company公司)，多功能酶標(biāo)儀(Thermo scientifice公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 FLS細(xì)胞培養(yǎng)

將CIA大鼠FLS細(xì)胞株從液氮中取出進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后的FLS細(xì)胞置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，使用胰酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代。選取第3—5代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 TNF-α對(duì)FLS細(xì)胞活性的影響

選取第3—5代對(duì)數(shù)期FLS細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)·(100 μL)-1接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清液，CON組加入完全培養(yǎng)基，TNF-α各濃度處理組分別加入含不同濃度TNF-α的完全培養(yǎng)基，使TNF-α終濃度分別為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 ng·mL-1，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h。參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。

1.2.3 Dio對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞活性的影響

選取第3—5代對(duì)數(shù)期CIA大鼠FLS細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)·(100 μL)-1接種于96孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清液。CON組加入完全培養(yǎng)基，TNF-α組加入含10 ng·mL-1TNF-α的完全培養(yǎng)基，Dio各濃度處理組分別加入含不同濃度Dio+10 ng·mL-1TNF-α的完全培養(yǎng)基，使Dio終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μg·mL-1，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至24 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，計(jì)算細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上[5]。

1.2.4 Dio對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞COX表達(dá)的影響

1.2.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及FLS細(xì)胞處理

本實(shí)驗(yàn)共分為6組：對(duì)照組(CON組)、TNF-α處理組(TNF-α組)、TNF-α+Dio處理1組(Dio 1組)、TNF-α+Dio處理2組(Dio 2組)、TNF-α+Dio處理3組(Dio 3組)、TNF-α+Dio處理4組(Dio 4組)。將FLS細(xì)胞1×105個(gè)·mL-1接種于6孔板中培養(yǎng)24 h棄上清液，將細(xì)胞與10 ng·mL-1的TNF-α共同孵育，CON組加入完全培養(yǎng)基，24 h后棄去培養(yǎng)基。CON組和TNF-α組加入含0.1% DMSO培養(yǎng)基，Dio 1組、Dio 2組、Dio 3組、Dio 4組分別加入1、2、3、4 μg·mL-1的Dio處理細(xì)胞24 h。

1.2.4.2 FLS細(xì)胞RNA的提取和檢測(cè)

收集各組FLS細(xì)胞，采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參，參照promega說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。熒光定量PCR檢測(cè)COX2和COX1的表達(dá)。COX2引物：上游5′-GCAATTATGAGTTATGTGTT-3′，下游5′-AGTATAATAGGAGAGGTTAGA-3′；COX1引物：上游5′-GGCAGCAGAGTTGGAGGAAT-3′，下游5′-ACTCCGGAGAACAGATGGGA-3′；GAPDH引物：上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游5′-GATGCAGGGATGATGTTC-3′。

1.2.4.3 FLS細(xì)胞蛋白的提取和檢測(cè)

收集上述各組FLS細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白。采用12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)模后以含5%牛奶的TBST封閉液中封閉2 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育2 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗37 ℃孵育2 h。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)拍照，通過(guò)Image.Pro Plus圖像分析綜合光密度值，以各組GAPDH作為標(biāo)準(zhǔn)參照，標(biāo)準(zhǔn)化其相應(yīng)組COX的蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對(duì)FLS細(xì)胞活性的影響

CON組，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 ng·mL-1TNF-α處理組FLS細(xì)胞存活率分別為(100.2±1.2)%、(100.5±2.2)%、(100.5±1.1)%、(107.3±1.1)%、(112.0±2.1)%、(110.2±1.3)%、(104.9±1.4)%、(103.3±1.1)%、(101.4±1.2)%；5.00、10.00、20.00、40.00、80.00 ng·mL-1TNF-α處理組FLS細(xì)胞存活率顯著高于CON組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明，以10.00 ng·mL-1的TNF-α與FLS細(xì)胞共同孵育24 h后，F(xiàn)LS細(xì)胞存活率最高。因此，本研究選用10 ng·mL-1的TNF-α與FLS細(xì)胞共同孵育24 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 Dio對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞活性的影響

CON組，TNF-α組，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 μg·mL-1Dio處理組FLS細(xì)胞存活率分別為(100.7±0.5)%、(111.7±2.2)%、(109.8±2.4)%、(83.7±0.5)%、(73.3±0.3)%、(56.8±0.5)%、(55.5±0.3)%、(46.0±0.8)%、(41.4±1.6)%、(29.8±0.2)%、(28.4±0.4)%、(23.6±0.4)%；結(jié)果顯示，當(dāng)Dio≥1.0 μg·mL-1時(shí)呈劑量依賴(lài)性抑制TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Dio對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞的IC50在2～3 μg·mL-1，因此，本研究Dio 1組、Dio 2組、Dio 3組、Dio 4組設(shè)定劑量為1、2、3、4 μg·mL-1。

2.3 Dio對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的FLS細(xì)胞COX表達(dá)的影響

TNF-α組COX1 mRNA表達(dá)水平較CON組顯著增加(P<0.01)，Dio 3組、Dio 4組COX1 mRNA表達(dá)水平較TNF-α組顯著減少(P<0.05或P<0.01)，Dio 1組、Dio 2組COX1 mRNA表達(dá)水平與TNF-α組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TNF-α組COX2 mRNA和蛋白表達(dá)水平較CON組均顯著增加(P<0.01)；Dio 1組、Dio 2組、Dio 3組COX2 mRNA表達(dá)水平較TNF-α組顯著減少(P<0.05或P<0.01)，Dio 4組COX2 mRNA表達(dá)水平與TNF-α組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Dio 1組、Dio 2組、Dio 3組、Dio 4組COX2蛋白表達(dá)水平較TNF-α組顯著減少(P<0.01)，且呈劑量依賴(lài)性的下調(diào)。見(jiàn)表1。

表1 各組FLS細(xì)胞COX表達(dá)水平比較

3 討論

RA是公認(rèn)的難以治愈的系統(tǒng)性自身免疫疾病，臨床患者主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫脹、畸形，甚至功能喪失、殘疾等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[6]。薯蕷皂苷是生產(chǎn)甾體激素類(lèi)藥物的重要基礎(chǔ)原，目前已有研究[7]表明在大鼠滑膜細(xì)胞系RSC-364的RA疾病模型中，薯蕷皂苷能夠通過(guò)抑制STAT3蛋白表達(dá)和NF-κB p65活性減少VEGF在mRNA的表達(dá)，達(dá)到治療RA的作用。此外，在CIA大鼠模型中，薯蕷皂苷能顯著降低大鼠足爪組織中TNF-α炎性因子的含量，且能明顯降低滑膜組織中COX2表達(dá)，從而減少PGE2的合成，發(fā)揮抗炎的作用[8]。

COX是合成各種前列腺素的關(guān)鍵酶，COX有兩種同工酶，即體內(nèi)固有的組成型COX1和正常表達(dá)極低、經(jīng)誘導(dǎo)后大量表達(dá)的誘導(dǎo)性COX2[9]。NSAIDs作為COX的制劑在臨床上廣泛應(yīng)用于RA的治療，并取得了良好的治療效果，表明COX在RA的發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，NSAIDs治療RA的機(jī)制主要是由于抑制RA誘發(fā)的COX2大量表達(dá)，影響PGE2的合成，從而達(dá)到治療效果。同時(shí)NSAIDs治療RA過(guò)程中的不良反應(yīng)主要是由于其對(duì)COX1的高度抑制引起的[11]。因此，在探索RA治療用藥的過(guò)程中，要保證既能有效抑制COX2的過(guò)量表達(dá)，又要考慮到對(duì)COX1表達(dá)無(wú)明顯影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Dio≤3 μg·mL-1時(shí)能不同程度地降低TNF-α誘導(dǎo)的CIA大鼠FLS細(xì)胞COX2 mRNA和蛋白的表達(dá)，表明了其對(duì)RA的治療效果。同時(shí)當(dāng)Dio≥3 μg·mL-1時(shí)亦能顯著降低COX1的表達(dá)，表明當(dāng)Dio濃度過(guò)高時(shí)可能產(chǎn)生一定的不良反應(yīng)，因此在用于RA的治療時(shí)要把握好Dio的用量。但是，在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)Dio濃度為4 μg·mL-1時(shí)，COX2 mRNA表達(dá)顯著升高而蛋白表達(dá)顯著下降，可能是由于高濃度Dio作用于TNF-α誘導(dǎo)的CIA大鼠FLS細(xì)胞時(shí)，作用效果與CUGBP2蛋白和COX-2 3′端ARE結(jié)合相似，促進(jìn)mRNA的穩(wěn)定性的同時(shí)抑制其翻譯過(guò)程，導(dǎo)致蛋白表達(dá)降低[12]。這也是后續(xù)研究所要解決的問(wèn)題之一。綜上所述，本研究將為臨床應(yīng)用Dio治療RA提供新的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。