余群慧, 田雪珂, 高 燕, 李飛翔, 肖桂然

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)又稱酪氨酸3-單加氧酶(tyrosine 3-monooxygenase),是一種催化L-酪氨酸使其苯環(huán)上羥基的鄰位發(fā)生羥基化而生成二羥苯丙氨酸即L-多巴的酶[1]。多巴是多巴胺的前體物質(zhì),而多巴胺又能生成去甲腎上腺素和腎上腺素等兒茶酚胺類物質(zhì),作為神經(jīng)遞質(zhì)和激素,與人類健康與疾病密切相關(guān),TH是這一類物質(zhì)體內(nèi)合成的限速酶。在動物體內(nèi)TH的表達(dá)部位十分廣泛,除了在腦部含兒茶酚胺的神經(jīng)元、交感神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)的去甲腎上腺素能神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)外,在腎上腺髓質(zhì)的去甲腎上腺素細(xì)胞和甲狀腺素細(xì)胞中也均有分布[2]。但TH在無脊椎動物和脊椎動物中高度保守,并具有多種生物學(xué)功能,例如在昆蟲的黑化、免疫反應(yīng)和神經(jīng)運(yùn)動等方面扮演著十分重要的角色。

研究表明,TH作為多巴胺生成通路中重要的酶,與許多神經(jīng)性疾病的發(fā)生具有緊密聯(lián)系[3],比如帕金森病、精神分裂癥、多動癥、躁郁癥等。帕金森病(簡稱PD),是一種常見于中老年人的發(fā)展緩慢的神經(jīng)退行性疾病,目前了解到的主要病理變化是由于黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的變性,進(jìn)而導(dǎo)致黑質(zhì)致密部內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥基苯乙酸的含量顯著減少[4-5]、但導(dǎo)致其發(fā)病的準(zhǔn)確分子機(jī)理尚不清楚。有研究顯示,帕金森模型大鼠腦內(nèi)的TH mRNA表達(dá)水平顯著降低,帕金森病可能與腦內(nèi)TH量密切相關(guān)[6]。由TH主導(dǎo)的多巴胺代謝調(diào)節(jié)與PD的發(fā)生密切相關(guān)。因此,對TH的深入研究為人類對相關(guān)疾病的治療提供了理論依據(jù)。

酪氨酸羥化酶催化酪氨酸生成左旋多巴,左旋多巴作為多巴胺的前體通過血腦屏障,對治療帕金森綜合癥等神經(jīng)性疾病具有很好的療效[7-9]。雖然左旋多巴有臨床副作用[10],但目前為止該藥物仍是治療帕金森綜合癥的金法則。最早的左旋多巴的生產(chǎn)均是從植物的種子中提取的[11],這對其大量生產(chǎn)造成了巨大的困難。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,越來越多的酶通過基因工程的手段得到了高水平的表達(dá),為特殊產(chǎn)物的生產(chǎn)帶來了便捷,使得越來越多的基因通過基因工程的手段得以表達(dá)。

本文從多巴胺合成關(guān)鍵限速酶TH入手,通過基因工程手段得到體外表達(dá)的蛋白,對于進(jìn)一步探究該蛋白的性質(zhì)以及調(diào)控是至關(guān)重要的,為后續(xù)實驗的開展奠定了堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 宿主菌和載體

大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5a、DE3和pET-28a載體由合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院分子營養(yǎng)學(xué)實驗室繁衍保存。

1.1.2 主要試劑

EasyTaq DNA Polymerase、BamHⅠ和Hind Ⅲ限制性快速內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase、T4 DNA Ligase buffer、dNTP mix、Trans2K Plus DNA Marker、6×DNA loading buffer均購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、氨芐青霉素、考馬斯亮藍(lán)R-250均購于北京普利萊公司;預(yù)染分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker、5×Protein loading buffer均購于Fermentas公司；無菌水、瓊脂糖、1×TAE電泳緩沖液、溴化乙錠儲存液。

1.1.3 主要儀器

高壓蒸汽滅菌鍋購于北京勤誠盛達(dá)科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋購于上海精宏實驗設(shè)備有限公司;超凈工作臺購于上海智城分析儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī)購于Beckman Coulter, USA;超低溫冰箱購于Thermo Fisher scientific;凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能科技有限公司;基因擴(kuò)增儀、恒溫培養(yǎng)振蕩器、脫色搖床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制

(1) LB液體培養(yǎng)基的配制。稱取1 g蛋白胨,0.5 g酵母粉及1 g NaCl,加入80 mL ddH2O,用NaOH調(diào)pH值至7.0～7.2,定容至100 mL,121 ℃高壓滅菌15 min。

(2) LB固體培養(yǎng)基的配制。100 mL LB液體培養(yǎng)基中加入1.2 g瓊脂粉,121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2.2 TH過表達(dá)載體的構(gòu)建1.2.2.1TH基因的獲得

(1) 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計所需引物,TH過表達(dá)載體選用BamHⅠ和HindⅢ 2個酶切位點(diǎn)。

所需引物如下:

FP:5’ATGCCCACCCCCGACGCCACCACGCCAC;

RP:5’CTAGCCAATGGCACTCAGCGCATG。

(2) 以cDNA為模板,用高保真擴(kuò)增酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增。

1.2.2.2TH基因與載體的重組

(1) 將回收的目的基因以及pET-28a載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ在37 ℃下進(jìn)行雙酶切。

(2) 用T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。

(3) 將連接過夜的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,用含有100 mg/mL氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基篩選陽性克隆。

(4) 挑取長勢正常的單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定,并用200 mg/mL IPTG誘導(dǎo)劑37 ℃誘導(dǎo)4 h,對表達(dá)菌表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增TH基因

以cDNA為模板擴(kuò)增TH基因片段,結(jié)果如圖1所示,圖1中，M為DNA Marker；1為TH基因PCR產(chǎn)物。由圖1可知,樣品PCR擴(kuò)增出了DNA片段,且在1 000～2 000 bp之間有一條明顯條帶。與期望得到的TH結(jié)構(gòu)基因片段相符,初步推斷已擴(kuò)增出目的基因片段。

圖1 PCR擴(kuò)增目的片段

2.2 TH過表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和pET-28a載體,酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果如圖2所示,圖2中,M為DNA Marker;1為TH基因PCR產(chǎn)物;2為載體酶切產(chǎn)物。由圖2可知,目的基因和載體均已發(fā)生雙酶切并獲得酶切產(chǎn)物,酶切后的基因和載體條帶清晰、大小正確,證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,可用于下一步實驗。

圖2 基因與載體酶切回收后電泳檢測

將酶切過的基因和載體用T4 DNA連接酶于16 ℃金屬浴中過夜連接,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入克隆載體E.coliDH5a,用含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選陽性單克隆,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,根據(jù)大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起。由此可以判斷平板上生長的是大腸桿菌,且未被雜菌污染。

圖3 轉(zhuǎn)化后的克隆載體大腸桿菌

挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并電泳檢測,TH過表達(dá)菌株的菌落的PCR鑒定結(jié)果如圖4所示,圖4中,M為DNA Marker;1～16為單菌落克隆(TH基因PCR產(chǎn)物)。由圖4可知,挑選的大部分單菌落都是陽性菌落，擴(kuò)增后條帶大小也正確。

圖4 菌落PCR的電泳圖

2.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及目的蛋白的定性測量

將陽性克隆的重組質(zhì)粒提取出來轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體E.coliBL21,對表達(dá)菌進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知,大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效果良好。

圖5 轉(zhuǎn)化后的克隆載體大腸桿菌

加入誘導(dǎo)劑IPTG在37 ℃誘導(dǎo)4 h,讓菌株表達(dá)目的蛋白,對細(xì)菌表達(dá)的蛋白考馬斯亮藍(lán)染色實驗,從而對表達(dá)菌表達(dá)的蛋白進(jìn)行定性測量,結(jié)果如圖6所示,圖6中,M為Protein weight marker；1為200 mg/mL IPTG誘導(dǎo)的產(chǎn)物；2為未誘導(dǎo)對照。

由圖6可知,通過誘導(dǎo)后和未誘導(dǎo)后的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果對比得知,黑色方框中表示的是表達(dá)的TH,而未誘導(dǎo)的沒有表達(dá)該蛋白。由蛋白質(zhì)Marker對照得知,TH蛋白的大小為56 kDa。

圖6 誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的考馬斯亮藍(lán)染色

將上述表達(dá)質(zhì)粒做蛋白的可溶性分析。超聲碎菌后上清與沉淀分別做SDS-PAGE,結(jié)果如圖7所示,圖7中,M為Protein weight marker;1～3分別為200 mg/mL IPTG誘導(dǎo)總蛋白、上清蛋白、沉淀蛋白。

圖7 考馬斯亮藍(lán)染色后的電泳圖

由圖7所知,黑色方框表明導(dǎo)入的TH基因已成功表達(dá),通過對不同部位的溶液進(jìn)行檢測,根據(jù)染色后的電泳圖條帶分析,得知TH的種類有可溶性和非可溶性之分。

3 討 論

隨著我國人口老齡化速度的加快[12],左旋多巴需求迅速增加。目前,國內(nèi)通過從貓豆等植物中提取的L-DOPA產(chǎn)量尚不能滿足這樣的需求,因此很大一部分依靠進(jìn)口。隨著代謝工程、合成生物學(xué)發(fā)展,天然產(chǎn)物藥物的異源生物合成受到越來越多的關(guān)注。通過生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法合成左旋多巴是今后研究的重要方向。因此,盡快使生物合成L-DOPA在國內(nèi)實現(xiàn)工業(yè)化以滿足不斷增長的市場需求。

本實驗從多巴胺合成的關(guān)鍵限速酶-酪氨酸羥化酶(TH)入手,利用基因工程技術(shù)進(jìn)行體外克隆該酶基因,并于大腸桿菌成功表達(dá)。對上述表達(dá)質(zhì)粒做蛋白的可溶性分析發(fā)現(xiàn),TH蛋白的種類有可溶性和非可溶性之分。本研究通過基因工程的手段體外表達(dá)TH,得到了預(yù)期的結(jié)果,對后期左旋多巴的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的幫助。

本文后續(xù)還有其他可深入研究的問題。通過構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體,能更方便地獲得TH。同理,可以將其他在動物或植物體內(nèi)難以表達(dá)的基因通過體外克隆轉(zhuǎn)入到表達(dá)載體,更方便獲得目的產(chǎn)物?？梢詫@得的TH蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析以及活性分析,為后續(xù)的研究奠定基礎(chǔ)。除此之外,可以進(jìn)行表達(dá)載體的優(yōu)化表達(dá)實驗。以本實驗為例,可以研究大腸桿菌表達(dá)載體在不同培養(yǎng)條件(例如溶氧量、溫度、培養(yǎng)時間)下的TH產(chǎn)量。是否添加誘導(dǎo)劑以及誘導(dǎo)劑的濃度對目的蛋白表達(dá)的影響,從而獲得濃度更高、活性更強(qiáng)的目的蛋白。