王平，聶振朋，孫立方，黃秀，徐建國，柯甫志

(浙江省柑橘研究所 國家品種改良分中心，浙江 黃巖 318026)

柑橘品種在自然受精的情況下普遍存在多倍體后代的現(xiàn)象，這種特性為柑橘實生苗選育不同倍性后代提供了基礎(chǔ)[1-4]。流逝細胞術(shù)法鑒定倍性快速、簡便、準確率高，是目前倍性選育的通用方法。由于葉片取材容易，目前包括柑橘在內(nèi)的不同物種流逝細胞術(shù)法鑒定倍性時，選取的部位大多采用葉片組織[1-6]。本研究比較了不同部位對柑橘實生幼苗倍性測定結(jié)果的影響，旨在選出不同柑橘品種倍性測定取材的最佳部位。

1 材料與方法

1.1 材料

3個砧木品種(枸頭橙、香橙和枳殼，2倍體材料)和4個柑橘栽培品種(本地早、日本夏橙、雞尾葡萄柚和真龍柚，2倍體材料)的種子去皮后播于蛭石中萌發(fā)，發(fā)芽2～3周(葉2～3片)后，分別取嫩根、嫩莖和嫩葉3個部位用于倍性鑒定。

1.2 倍性測定

檢測試劑采用Sysmex公司生產(chǎn)CyStain UV Precise P試劑盒，即先加0.4 mL提取液置于樣品表面，用刀片切碎葉片培養(yǎng)30 s后過濾出液體，加1.6 mL DNA染色液后待測。儀器采用CyFlow? Space PARTEC流式細胞儀。以2倍體本地早嫩根為固定參考系，電壓設(shè)置為2倍體本地早的第1個樣本出峰值在90左右。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個品種測定10株重復(fù)，計算平均值、標準偏差和偏離均值度。偏離均值度/%=|(測定值-均值)|/均值×100，10個測定值中最大的偏離均值度用V表示。顯著性差異分析采用IBM SPSS統(tǒng)計軟件的Duncan多重比較法(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘不同部位流逝細胞術(shù)鑒定的出峰圖

柑橘實生幼苗的嫩葉、嫩莖和嫩根3個部位出峰結(jié)果有所不同。除第1個雜質(zhì)峰外，嫩葉(圖1中A)和嫩莖只出一個明顯的樣本峰，嫩根(圖1中B)出現(xiàn)兩個明顯的樣本峰，且第2個樣本峰值是第1個的2倍。這可能跟嫩根細胞處于活躍的分裂周期有關(guān)。本試驗計算嫩根出峰值時以第1個樣本峰值為準。

2.2 不同柑橘品種不同部位倍性測定結(jié)果比較

表1顯示，在被測的3個砧木品種中，不同部位出峰值均較穩(wěn)定，不同部位的測定均值未達到5%的顯著性差異。表2顯示，在栽培品種中，同一品種不同部位的出峰均值存在差異，本地早、日本夏橙和雞尾葡萄柚3個栽培品種嫩根的出峰值明顯要比嫩葉的大，其出峰均值分別為嫩葉的1.38倍、1.35倍和1.22倍，而真龍柚不同部位測定均值差異相對較小。在被測的7個品種中，根的測定結(jié)果均很穩(wěn)定，不同品種的最大偏離均值僅浮動在1.8%～6.4%(表1和表2)；不同植株葉片測定結(jié)果穩(wěn)定性最差，尤其是本地早和日本夏橙兩個品種，葉片測定值中偏離均值最高分別達到33.3%和24.1%(表2)，一定程度上影響倍性結(jié)果判斷。

橫坐標表示DNA含量；縱坐標表示所檢測的細胞數(shù)量圖1 枸頭橙嫩葉(A)和嫩根(B)的出峰情況

表1 砧木不同部位實生幼苗出峰值

表2 栽培品種不同部位實生幼苗出峰值

3 小結(jié)

流逝細胞術(shù)在植物倍性育種工程中普遍應(yīng)用，目前柑橘上利用流逝細胞儀測定倍性的部位普遍采用柑橘嫩葉[1-4]，而本試驗比較2倍體實生幼苗不同部位后得出柑橘葉片測定最不穩(wěn)定、數(shù)據(jù)標準差最大，莖次之，根最小；但不同組織對砧木品種測定結(jié)果影響較小。被測的7個柑橘品種中，本地早、日本夏橙柑橘品種實生幼苗葉片測定值中偏離均值最高分別達到33.3%和24.1%，用葉片組織篩選這兩個品種的3倍體植株就會出現(xiàn)一定幾率的假陽性。同時用葉片檢測時容易出現(xiàn)樣本峰不能很好分離，易造成檢測儀器堵塞。這可能跟葉片組織中含有豐富的次生代謝物質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，用流逝細胞儀對柑橘品種的實生苗進行倍性選育時，尤其是栽培品種的三倍體植株鑒定時，取材部位宜選用嫩根組織。