楊玥熹 曹一丹 俞安珍 陳 晴 顧振宇

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，杭州 310018)(國家級食品工程與質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心2，杭州 310018)

RS3型抗性淀粉，即回生淀粉，糊化淀粉在冷卻過程中形成結(jié)晶，從而抗消化性增強(qiáng)。RS3型抗性淀粉應(yīng)用較為廣泛的制備工藝主要有以下3種[1-3]：熱液處理、脫支處理和擠壓處理。熱液處理是目前最常見的抗性淀粉制備方法，通過控制淀粉乳濃度及處理溫度達(dá)到增抗效果[4]；脫支處理主要通過酶法或酸法處理將長鏈淀粉分子切割成長度適宜的直鏈淀粉分子，淀粉分子依靠分子間的締結(jié)作用形成穩(wěn)定的抗酶解結(jié)構(gòu)[5]；擠壓處理主要是淀粉分子在高溫高壓的作用下，部分糖苷鍵斷裂所產(chǎn)生的線性淀粉分子相互聚合形成抗酶解結(jié)構(gòu)[6]。為提高抗性淀粉得率與制備效率，目前也有通過將多種方法結(jié)合使用，以達(dá)到將淀粉分子 “解構(gòu)”并“重構(gòu)”的目的。

目前，工業(yè)化的RS3型抗性淀粉多選用高直鏈玉米淀粉為原料，循環(huán)老化過程中能耗大，生產(chǎn)成本高，純度在50%左右。在功能淀粉加工領(lǐng)域，抗性淀粉純化工藝的改良以及抗性淀粉生產(chǎn)的新原料的篩選受到持續(xù)關(guān)注。

芡實(shí)中淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)70%～80%，體外消化過程中還原糖及可溶性糖的釋放率均低于米淀粉[7]。目前關(guān)于芡實(shí)的研究多集中在微量營養(yǎng)成分(如黃酮、多酚)提取和功能評價(jià)，而忽略了對主要營養(yǎng)成分淀粉的研究。我國的芡實(shí)加工還處于初級階段，具有很大的開發(fā)潛力與市場前景。本研究可為芡實(shí)等特種谷物雜糧類為原料的抗性淀粉生產(chǎn)和結(jié)構(gòu)調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干芡實(shí)(產(chǎn)地：蘇州)；中溫α-淀粉酶 (10 000 U/g)、普魯蘭酶(1 500 U/mL)、耐高溫α-淀粉酶(4 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/mL)、低溫α-淀粉酶(2 000 U/g)、胃蛋白酶(10 000 U/g)；氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Five Easy Plus pH計(jì)，G8X-9140MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，DSX-280B手提式壓力蒸汽滅菌器，DFY-1000高速搖擺粉碎機(jī)(旋轉(zhuǎn)刀片轉(zhuǎn)速25 000 r/min)，SCIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，Q2000差式量熱掃描儀，SU8010場發(fā)射掃描電鏡 (FESEM)。

1.3 方法

1.3.1 芡實(shí)淀粉的制備

將干芡實(shí)用高速搖擺粉碎機(jī)粉碎(15 s × 3次)后過100目篩，得芡實(shí)粉，密封后于室溫保存。

芡實(shí)淀粉(ES)參照趙梅[8]的方法制備。制得芡實(shí)淀粉純度為86.4%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.3%，含水量為9.2%。

1.3.2 增抗芡實(shí)淀粉制備工藝優(yōu)化

1.3.2.1 酶-壓熱法增抗芡實(shí)淀粉制備工藝優(yōu)化

酶-壓熱法增抗芡實(shí)淀粉(EA-ERS)的制備參照燕玲娟[9]的方法，并對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。單因素實(shí)驗(yàn)條件為：淀粉乳濃度20%；普魯蘭酶反應(yīng)條件為pH 4.6，60 ℃，2 h，4 U/g；壓熱溫度120 ℃，時(shí)間20 min。保持其余條件不變，以RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價(jià)指標(biāo)，分別改變淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)(10%、15%、20%、25%、30%)、普魯蘭酶用量(1、2、3、4、5 U/g)、普魯蘭酶作用時(shí)間(1、1.5、2、2.5、3 h)、壓熱溫度(95、100、105、110、115、120、125 ℃)、壓熱時(shí)間(10、20、30、40、50 min)。

1.3.2.2 壓熱法-增抗芡實(shí)淀粉的制備

壓熱法-增抗芡實(shí)淀粉(A-ERS) 的制備參照張濤鑠等[10]的方法。淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，121 ℃壓熱處理30 min，4 ℃冷藏時(shí)間15 h。

1.3.2.3 雙酶法-增抗芡實(shí)淀粉的制備

雙酶法-增抗芡實(shí)淀粉(DE-ERS)的制備參照周穎等[11]的方法。淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)24.5%，4 U/g(干基淀粉)的中溫α-淀粉酶作用25 min，4 U/g(干基淀粉)普魯蘭酶作用1.5 h。

1.3.3 增抗芡實(shí)淀粉純化的工藝優(yōu)化

純化步驟：酶-壓熱增抗淀粉(EA-ERS)與水按1∶9配制懸濁液，于90 ℃水浴糊化30 min后冷卻至40 ℃。酶解，后進(jìn)行滅酶處理(100 ℃，15 min)。待淀粉糊冷卻至室溫后離心(4 000 r/min，5 min)取沉淀，加入4倍體積的洗劑，攪拌均勻后于室溫下靜置1 h后離心取沉淀，重復(fù)洗滌操作3次后干燥，用高速搖擺粉碎機(jī)粉碎(15 s × 3次)，過100目篩。

酶解過程中使用的酶包括：胃蛋白酶(pH 2.0，40 ℃，2 h，15 U/g干基淀粉)；高、中、低溫α-淀粉酶(pH 6.0，最適酶解溫度下酶解，2 h，10 U/g 干基淀粉)；糖化酶(pH 4.6，60 ℃，2 h，50 U/g干基淀粉)。若未特殊說明，洗劑為95%乙醇，干燥方式為50 ℃鼓風(fēng)干燥。

通過單因素實(shí)驗(yàn)探究不同酶組合、淀粉酶種類、洗劑對芡實(shí)抗性淀粉純度及得率的影響，以確定最優(yōu)的芡實(shí)抗性淀粉純化工藝及參數(shù)?？剐缘矸奂兌炔捎?.3.3中抗性淀粉含量測定方法進(jìn)行測定，所得抗性淀粉含量即為抗性淀粉純度。RS得率為純化后所得抗性淀粉質(zhì)量占純化前增抗淀粉質(zhì)量的百分比。

1.3.3.1 不同酶解實(shí)驗(yàn)

改變酶的種類及添加順序，其余條件不變。(A1)依次加入胃蛋白酶、耐高溫α-淀粉酶；(A2)依次加入胃蛋白酶、糖化酶；(A3)依次加入耐高溫α-淀粉酶、糖化酶；(A4)依次加入胃蛋白酶、耐高溫α-淀粉酶和糖化酶。

1.3.3.2 不同α-淀粉酶

采取A4組的酶解方式，胃蛋白酶酶解后分別加入(B1)低溫α-淀粉酶(酶解溫度40 ℃)；(B2)中溫α-淀粉酶(酶解溫度70 ℃)；(B3)耐高溫α-淀粉酶(酶解溫度90 ℃)；(B4)不添加α-淀粉酶。

1.3.3.3 不同洗劑

采取A4組的酶解方式，洗劑分別選擇(C1)蒸餾水；(C2)85%乙醇溶液；(C3)95%乙醇溶液；(C4)不進(jìn)行洗滌處理。

1.3.3.4 不同增抗方法

采取A4組的酶解方式，分別對(D1)芡實(shí)淀粉(ES)；(D2)酶-壓熱增抗芡實(shí)淀粉(EA-ERS)；(D3)壓熱法增抗芡實(shí)淀粉(A-ERS)；(D4)雙酶法增抗芡實(shí)淀粉(DE-ERS)進(jìn)行純化。

1.3.3.5 不同干燥方式

將A4組干燥方式由鼓風(fēng)干燥換為冷凍干燥。

1.3.4 抗性淀粉(RS)含量測定

參照AOAC 2002.02的方法進(jìn)行[12]。

1.3.5 直鏈淀粉含量的測定

參考戴雙等[13]的方法，采用雙波長法確定直鏈淀粉含量。測定波長λ1為595 nm，參比波長λ2為430 nm。

1.3.6 熱特性的測定

樣品按料液比1∶3配制淀粉懸濁液并置于鋁盒中，將蓋子密封后放入差式量熱掃描儀(DSC)樣品槽中，以空白樣品池作為參比，通入氮?dú)猓?0 ℃/min的升溫速率從 40 ℃升至160 ℃ 進(jìn)行掃描測定[14]。利用配套分析軟件計(jì)算淀粉樣品的熔融態(tài)起始溫度(To)，峰值溫度(Tp)，終止溫度(Tc)和焓變?chǔ)。

1.3.7 表面顆粒形態(tài)的測定

將樣品干燥至恒重后，固定于樣品臺(tái)上噴金，然后采用掃描電鏡對樣品進(jìn)行表面顆粒形態(tài)觀察，電鏡放大倍數(shù)為2 000×和5 000×。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值，采用SPSS 21.0軟件中的單因素方差分析(one-way，ANOVA)檢驗(yàn)顯著性水平(檢驗(yàn)水平P選擇為 0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶-壓熱增抗淀粉(EA-ERS)制備工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

由圖1可知，淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、普魯蘭酶作用時(shí)間、壓熱時(shí)間對抗性淀粉含量的影響較為顯著；當(dāng)普魯蘭酶用量為4 U/g時(shí)效果最佳。普魯蘭酶主要通過切斷淀粉分子中的α-1,6 糖苷鍵，從而增加淀粉中直鏈淀粉的比例，以利于形成更多的RS3型抗性淀粉；而當(dāng)普魯蘭酶過量時(shí)，再增加酶用量對EA-ERS的RS含量無明顯影響[15]。在一定范圍內(nèi)，壓熱溫度對RS含量的影響較小，且當(dāng)壓熱溫度為120 ℃時(shí)效果最佳。適宜的酶解時(shí)間可極大程度上提高淀粉RS含量，但酶解時(shí)間過長反而會(huì)降低淀粉RS含量[16]。

圖1 酶-壓熱法單因素對抗性淀粉含量的影響

2.1.2 響應(yīng)面法優(yōu)化

2.1.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析可知，選取淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)、普魯蘭酶作用時(shí)間、壓熱時(shí)間這3個(gè)對抗性淀粉得率影響較大的因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，其因素水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 酶-壓熱法制備芡實(shí)增抗淀粉響應(yīng)面因素水平表

2.1.2.2 響應(yīng)面回歸模型及方差分析

響應(yīng)面回歸模型方程為：抗性淀粉含量=18.21+1.11A+0.64B+0.71C+0.42AC-0.44AB+0.47BC-1.92A2-0.67B2-1.06C2。

表2 酶-壓熱法制備增抗芡實(shí)淀粉的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表3可知，所建模型P<0.000 1，失擬項(xiàng)P>0.05，二次模型成立。且A2>C2>B2，說明EA-ERS中RS含量的影響因素主次為淀粉乳質(zhì)量濃度>壓熱時(shí)間>普魯蘭酶作用時(shí)間。在酶-壓熱法中，控制壓熱時(shí)間是提高RS含量最關(guān)鍵的因素。

表3 酶-壓熱法制備增抗芡實(shí)淀粉的回歸方程方差分析

2.1.2.3 響應(yīng)面分析與工藝優(yōu)化

由圖2a可知，淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)與壓熱時(shí)間兩因素對抗性淀粉含量的交互作用較為顯著，等高線圖呈橢圓形，曲面圖比較陡峭；由圖2b可知，淀粉乳質(zhì)量濃度與普魯蘭酶作用時(shí)間兩因素對抗性淀粉含量的交互作用并不顯著，曲面較為平坦由。由圖2c可知，隨著普魯蘭酶作用時(shí)間和壓熱時(shí)間的增加，響應(yīng)值呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢，等高線呈橢圓形，曲面圖比較陡峭，兩者交互作用較為顯著。

圖2 響應(yīng)面和等高線圖

綜上所述，根據(jù)響應(yīng)面分析預(yù)測的最佳條件，并綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)及能源損耗等因素，確定了酶-壓熱增抗工藝的最優(yōu)條件為：淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.5%，普魯蘭酶作用時(shí)間2.3 h，壓熱時(shí)間23 min，可得到RS質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(18.34±0.21)% (n=3)的酶-壓熱增抗淀粉(EA-ERS)，與模型預(yù)測值18.74%的相對誤差小于3%，說明2.1.2.2中回歸模型與實(shí)際情況擬合較好，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.2 芡實(shí)抗性淀粉純化工藝優(yōu)化

去除非抗性部分是提高抗性淀粉純度的常見方式。由圖3可知，對于不同的酶解方案，依次加入胃蛋白酶、耐高溫α-淀粉酶和糖化酶(A4組)后芡實(shí)RS3純度最高，為(57.76±0.01)%。這可能是由于胃蛋白酶酶解了部分包裹在EA-ERS表面的蛋白質(zhì)，使得淀粉能夠更好地暴露并與淀粉酶接觸發(fā)生水解[11]。α-淀粉酶與糖化酶的協(xié)同作用，可使淀粉分子中的α-1,4和α-1,6 糖苷鍵快速斷裂，從而提升了純化效果[17]。

根據(jù)酶解最適溫度的不同，α-淀粉酶可以分為高溫、中溫和低溫型。由圖3所示，分別經(jīng)過高溫、中溫和低溫α-淀粉酶作用所得芡實(shí)RS3得率無明顯差異(P>0.05)。經(jīng)低溫α-淀粉酶 (B1組)處理的芡實(shí)RS3純度最高，達(dá)(73.66±0.85)%。這可能是由于低溫α-淀粉酶分子內(nèi)基團(tuán)相互作用較弱，分子柔韌度較高[17]，使其與淀粉分子之間的接觸面積增大，提高了酶解效率。

為進(jìn)一步提高芡實(shí)RS3的純度，需要除去淀粉酶解后產(chǎn)生的小分子糖和無機(jī)鹽。由圖3可知，蒸餾水作為洗劑得到芡實(shí)RS3純度最高。這可能是由于乙醇在可溶解小分子糖的同時(shí)也會(huì)抑制淀粉顆粒吸水膨脹；且隨著乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，這種抑制作用也增強(qiáng)[18,19]；經(jīng)乙醇處理后的淀粉分子中雙螺旋結(jié)構(gòu)可能會(huì)瓦解，并轉(zhuǎn)變?yōu)閱温菪Y(jié)構(gòu)與乙醇結(jié)合形成V型復(fù)合體[20]。

注：不同字母表示有顯著性差異 (P<0.05)。圖3 不同處理方式對芡實(shí)抗性淀粉純度(a)及得率(b)的影響

不同方法制備的增抗淀粉純化后得率沒有顯著性差異(P>0.05)，而純度差異顯著(P<0.05)，主要由于不同增抗方法制備的增抗淀粉分子微觀結(jié)構(gòu)與結(jié)晶的差異所致。已有研究表明，冷凍干燥可有效保留淀粉原有結(jié)晶結(jié)構(gòu)，保持淀粉顆粒完好[21]；鼓風(fēng)干燥時(shí)淀粉樣品表面水分快速蒸發(fā)，內(nèi)部水分遷移速率較慢，造成淀粉顆粒表面皺縮，結(jié)晶結(jié)構(gòu)有一定破壞[22,23]。冷凍干燥處理后的芡實(shí)RS純度為(67.75±0.60)%，顯著高于鼓風(fēng)干燥A4組(P<0.05)。

芡實(shí)抗性淀粉純化的優(yōu)選條件為：依次進(jìn)行胃蛋白酶(pH 2.0，40 ℃，1 h，15 U/g干基淀粉)、低溫α-淀粉酶(pH 6.0，45 ℃，2 h，10 U/g干基淀粉)和糖化酶(pH 4.6，60 ℃，2 h，100 U/g 干基淀粉)酶解，離心，蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥。

2.3 抗性淀粉和直鏈淀粉含量分析

表4展示了酶-壓熱法(按照2.1.2.3中確定的最優(yōu)條件)、壓熱法(按照1.3.2.2所示方法)、雙酶法(按照1.3.2.3所示方法)制備的芡實(shí)增抗淀粉A-ERS、EA-ERS、DE-ERS，以及根據(jù)2.2中的優(yōu)選條件進(jìn)一步純化后的芡實(shí)抗性淀粉P-A-ERS、P-EA-ERA、P-DE-ERS中直鏈淀粉含量和抗性淀粉(RS)含量。三種增抗芡實(shí)淀粉中RS含量沒有顯著性差異P>0.05)，三種抗性淀粉中RS含量P-A-ERS

表4 不同淀粉樣品中抗性淀粉和直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%

2.4 熱特性分析

淀粉受熱過程中的焓變(ΔH)與淀粉雙螺旋解構(gòu)有關(guān)，可以反映結(jié)晶形成的質(zhì)量和程度[25]；淀粉顆粒中To、Tp、Tc的升高表示淀粉顆粒中有更多的雙螺旋結(jié)構(gòu)和結(jié)晶體[26]，糊化溫度范圍(Tc～To)表示顆粒內(nèi)淀粉微晶的均勻程度[27]。相比于芡實(shí)淀粉(ES)，增抗淀粉的To、Tp、Tc、ΔH均有顯著提高(P<0.05)，說明在增抗過程中形成了更加緊密的晶型結(jié)構(gòu)高，熱穩(wěn)定性提升[27]。壓熱處理的A-ERS由于未經(jīng)酶解，分子鏈較長，回生過程中形成的結(jié)晶結(jié)構(gòu)更緊密[28]，因此其To、Tp、Tc、ΔH高于其它兩種增抗芡實(shí)淀粉。相比于對應(yīng)的增抗淀粉，純化后芡實(shí)抗性淀粉的To、Tp、Tc、(Tc～To)顯著下降，ΔH顯著上升，表明純化中的酶解過程對芡實(shí)抗性淀粉結(jié)晶有一定的降解，但是結(jié)晶質(zhì)量更高，更為均勻。P-EA-ERS糊化溫度范圍最窄，表示其淀粉顆粒結(jié)構(gòu)最均勻。

2.5 淀粉顆粒表面形態(tài)分析

如圖4所示，未經(jīng)增抗處理的ES顆粒呈規(guī)則多面體狀，表面光滑。酶-壓熱處理的EA-ERS經(jīng)過壓熱與酶解，顆粒形態(tài)與A-ERS與DE-ERS均有類似，整體呈不規(guī)則碎片狀，表面出現(xiàn)片層褶皺。表明芡實(shí)淀粉的增抗過程破壞了原有淀粉結(jié)構(gòu)，并在回生階段重新聚集形成了結(jié)構(gòu)較為緊密穩(wěn)定的新晶體[29]。

如圖5所示，經(jīng)純化后所得芡實(shí)抗性淀粉顆粒均呈現(xiàn)蜂窩狀，表面粗糙。雙酶處理使得淀粉分子片段較小，從而增大了其可酶解成分與淀粉酶的接觸面積[30]，是純化效果較好的原因之一。

表5 不同淀粉的熱力學(xué)參數(shù)

注：ES 芡實(shí)淀粉； A-ERS 壓熱法芡實(shí)增抗淀粉； EA-ERS 酶-壓熱法芡實(shí)增抗淀粉； DE-ERS 雙酶法芡實(shí)增抗淀粉, a 2 000×，b 5 000×。圖4 不同淀粉樣品的掃描電鏡圖

注：P-A-ERS 壓熱法芡實(shí)抗性淀粉；P-EA-ERS 酶-壓熱法芡實(shí)抗性淀粉；P-DE-ERS 雙酶法芡實(shí)抗性淀粉,a 2 000×，b 5 000×。圖5 不同純化樣品的掃描電鏡圖

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了酶-壓熱法芡實(shí)淀粉的增抗工藝，得到與實(shí)際情況擬合良好的響應(yīng)面回歸模型。芡實(shí)淀粉最優(yōu)增抗工藝為：淀粉乳質(zhì)量分?jǐn)?shù)26.5%，4 U/g干基淀粉普魯蘭酶酶解2.3 h，120 ℃壓熱23 min。通過單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選的芡實(shí)抗性淀粉純化工藝為：依次進(jìn)行胃蛋白酶(pH 2.0，40 ℃，1 h，用量15 U/g干基淀粉)、低溫α-淀粉酶(pH 6.0，45 ℃，2 h，用量10 U/g干基淀粉)和糖化酶(pH 4.6，60 ℃，2 h，用量100 U/g干基淀粉)酶解，蒸餾水洗滌3次后冷凍干燥。經(jīng)上述條件純化后，所得三種芡實(shí)抗性淀粉(P-A-ERS、P-EA-ERS、P-DE-ERS)得率無顯著性差異(P>0.05)，純度高低依次為P-DE-ERS>P-EA-ERS>P-A-ERS，均大于80%，顆粒呈現(xiàn)多孔狀；酶-壓熱法芡實(shí)抗性淀粉(P-EA-ERS)直鏈淀粉含量最高，糊化溫度范圍最窄。本研究可為高純度、結(jié)構(gòu)可控的RS3型抗性淀粉的生產(chǎn)提供借鑒。