丁曉嬌,章海斌,趙 報,殷文博,陳 瑩,王子安*

(1蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤內科,蚌埠 233000;2蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:wangzian118@sina.com)

胃癌(gastric cancer,GC)是常見的消化道惡性腫瘤之一,全球腫瘤發(fā)病率中位居第六,死亡率位居第四[1]。目前胃癌治療方式主要包括手術輔助化療以及靶向治療等,然而晚期胃癌患者總體預后仍舊較差,術后5年生存率不足30%[2],這與腫瘤的易復發(fā)、易轉移特性密不可分。因此,尋找新的生物標志物和治療靶點對胃癌的治療具有重要意義。

微小RNA(microRNAs,miRNA)是一類內源性、進化保守的非編碼RNA,通過與靶RNA的3′-UTR結合,導致靶mRNA的降解及其翻譯抑制,調節(jié)細胞的多種基本生理過程如細胞增殖、細胞凋亡及腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-5]。多項研究證明,miR-10a-5p在膽管癌[6]、乳腺癌[7]、宮頸癌[8]等多種腫瘤中表達異常,參與調控其惡性生物學行為。然而,對于miR-10a-5p在胃癌侵襲遷移中的作用及其分子機制,研究仍舊較少。維甲酸受體相關孤兒受體A(RAR-related orphan receptor A,RORA)基因在人類染色體定位于15q22.2,是孤兒受體ROR子家族的成員之一。研究表明,RORA在肺癌[9]、肝癌[10]、卵巢癌[11]、皮膚黑色素瘤[12]等多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在探討miR-10a-5p在胃癌的侵襲遷移中扮演的角色,為胃癌臨床治療尋找新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

正常人胃黏膜上皮細胞GES-1、人胃癌細胞株(AGS、SGC-7901、BGC-823)購自IBS細胞資源中心;RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司;胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒及蛋白印跡(Western blot)試劑盒、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素雙抗均購自碧云天生物技術公司;miR-10a-5p inhibitor、NC、RORA過表達序列均購自上海吉瑪基因有限公司;轉染試劑Lipofectamine?2000購自ThermoScientific公司;一抗(β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail)及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗均購于武漢三鷹生物技術公司;ECL顯影液購于Abbkine公司;GAPDH引物、U6引物、miR-10a-5p、RORA引物均購自上海生工生物工程股份有限公司;Trizol、RNA逆轉錄試劑盒購自Thermo Scientific有限公司;TB Green TM Primix Ex Taq TM試劑盒購自日本TaKaRa公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自Biofroxx公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

正常人胃黏膜上皮細胞GES-1、人胃癌細胞株(AGS、SGC-7901、BGC-823)培養(yǎng)于含100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,48 h更換培養(yǎng)液。當細胞融合達到90%時,0.25%胰酶消化后傳代,取傳3代細胞進行后續(xù)實驗。取傳3代的SGC-7901細胞,胰酶消化后計數(shù),細胞鋪板,待細胞融合50%-80%時進行轉染,轉染步驟嚴格按照轉染說明書進行。為了探討miR-10a-5p是否通過靶向RORA對胃癌細胞侵襲、遷移產(chǎn)生影響及其機制,將SGC-7901細胞分為control組(只轉染Lipofectamine?2000)、NC組(轉染Lipofectamine?2000及NC序列,序列5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)和miR-10a-5p inhibitor組(Lipofectamine?2000及miR-10a-5p inhibitor,序列5′-CACAAA-UUCGGAUCUACAGGGUA-3′)。通過qRT-PCR檢測轉染miR-10a-5p inhibitor后miR-10a-5p及RORA的相對表達水平;通過克隆形成實驗檢測miR-10a-5p inhibitor對細胞增殖能力的影響;Western blot檢測β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白的表達;miR-10a-5p對細胞侵襲和遷移的影響由Transwell實驗檢測。同時對SGC-7901轉染RORA過表達序列,方法如上,實驗分為control組(只轉染Lipofectamine?2000)、NC組(轉染Lipofectamine?2000及NC序列)和RORA過表達組(轉染Lipofectamine?2000及RORA過表達序列)。通過Transwell實驗檢測RORA對細胞侵襲和遷移的影響。

1.3 實時熒光定量PCR檢測miR-10a-5p及RORA相對表達

0.25%胰酶消化收集實驗組及對照組細胞,用Trizol提取細胞內總RNA,將提取的RNA用RNA反轉錄試劑盒說明反轉錄RNA為cDNA,合成的cDNA用TB GREEN試劑盒通過PCR儀進行PCR擴增,以U6為內參檢測miR-10a-5p在正常胃黏膜細胞GES-1及GC細胞株AGS、SGC-7901、BGC-823中的表達水平。分別以U6與GAPDH為內參檢測miR-10a-5p及RORA相對表達量,最終Ct值采用2-ΔΔCt進行分析,引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列

實時熒光定量PCR采用兩步法PCR擴增標準程序。stage 1:預變性(95 ℃,30 s),Stage 2:PCR反應(95 ℃,5 s;60 ℃,30 s),共40個循環(huán),采用2-ΔΔCt法計算miR-10a-5p相對表達量,所有試驗均重復3次。

1.4 Western blot檢測β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白的表達

0.25%胰酶消化收集SGC-7901細胞,分別加入適量RIPA細胞裂解液(含0.1%蛋白酶抑制劑),置于冰上裂解30 min,將細胞裂解液轉移至1.5 ml離心管中,-20 ℃冰箱過夜,次日4 ℃、12 000 r/min離心30 min,收集上清液,BCA法進行蛋白定量。分別取50 μg蛋白進行SDS-PAGE,恒壓100 V 70 min,冰浴轉膜至PVDF膜上;快速封閉液封閉15 min;加入按1 ∶1 000稀釋的一抗(β-actin、RORA、E-cadherin、N-cadherin、Snail),4 ℃搖床孵育過夜;次日,TBST洗膜3次,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h;TBST洗滌3次,ECL化學發(fā)光顯像。以β-actin為內參,采用Image J圖像分析軟件計算目的蛋白相對表達量。

1.5 靶基因檢測及驗證

根據(jù)生物信息學軟件Target Scan預測miR-10a-5p和RORA 3′ UTR存在結合位點,提示RORA可能是miR-10a-5p的直接靶基因。為證實該推測,研究通過qRT-PCR及Western blot分別檢測RORA mRNA及蛋白表達水平,實驗分組及方法如1.2-1.4。

1.6 克隆形成實驗檢測增殖能力

收集轉染后control組、NC組、轉染miR-10a-5p inhibitor組細胞,胰酶消化后用RPMI-1640培養(yǎng)基重懸,以1 000個/孔密度接種于6孔板中,37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。棄去培養(yǎng)基,用PBS洗滌2遍,加入4%多聚甲醛,-20 ℃固定10 min,結晶紫染色,靜置20 min,使用4 ℃預冷的雙蒸水洗滌,室溫下晾干,拍照并記錄結果。

1.7 Transwell實驗檢測miR-10a-5p對細胞侵襲和遷移的影響

Transwell實驗用來分別檢測miR-10a-5p對胃癌細胞侵襲及遷移能力的影響。檢測侵襲能力時,將Materigel膠與Opti按1 ∶8的比例稀釋,每孔加入60 μl的Materigel膠均勻覆蓋Transwell小室底部,培養(yǎng)60 min。取轉染后control組、NC組、轉染miR-10a-5p inhibitor組細胞,胰酶消化后用無血清1640培養(yǎng)基重懸,調整至5×104個/孔密度加入到Transwell小室上室中,下室加入600 μl含10% FBS的1640培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)48 h。用潤濕的棉簽小心擦去小室上層細胞并用雙蒸水洗滌,在24孔板中每孔加入600 μl的4%多聚甲醛固定15 min,結晶紫染色20 min,雙蒸水洗滌后室溫晾干,100倍顯微鏡下隨機選取5個視野拍照記錄,Image J軟件進行計數(shù),細胞數(shù)取平均值。遷移實驗不鋪膠,其余操作同侵襲實驗相同。

1.8 轉染RORA過表達序列對細胞侵襲和遷移的影響

為進一步驗證miR-10a-5p靶向調控RORA的表達是否影響SGC-7901細胞增殖、侵襲和遷移,本研究設RORA OE轉染組control組(只轉染Lipofectamine?2000)、RORA NC轉染組(轉染Lipofectamine?2000及NC序列)、RORA過表達組(Lipofectamine?2000及RORA過表達序列)。轉染48 h采用Transwell實驗檢測RORA對SGC-7901細胞侵襲和遷移能力的影響,方法同1.7。

1.9 統(tǒng)計學分析

所有試驗重復3次,采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析,結果以均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較則采用LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-10a-5p在GC細胞中的表達

qRT-PCR檢測結果顯示,與正常人胃黏膜上皮細胞GES-1相比,miR-10a-5p在不同GC細胞(AGS、SGC-7901、BGC-823)中的表達量有不同程度的升高,其中在SGC-7901細胞中表達量最高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1),故選擇該細胞株進行后續(xù)實驗。

與GES-1細胞相比,*P<0.05圖1 miR-10a-5p在不同胃癌細胞株中表達量的比較Figure 1 Expression of miR-10a-5p in different gastric cancer cell lines

2.2 轉染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細胞中miR-10a-5p表達的影響

qRT-PCR檢測結果顯示,miR-10a-5p inhibitor轉染組SGC7901細胞中miR-10a-5p的表達量顯著低于control組和NC組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖2 轉染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細胞中miR-10a-5p表達的影響Figure 2 Effect of miR-10a-5p inhibitor on miR-10a-5p expression in SGC-7901 cells

2.3 miR-10a-5p靶向調控RORA

生物信息學軟件Target Scan預測結果顯示,RORA 3′UTR上存在潛在的與miR-10a-5p靶向結合的位點(見圖3A),說明RORA可能是miR-10a-5p的靶基因。qRT-PCR結果顯示,在胃癌細胞SGC-7901中RORA mRNA表達水平miR-10a-5p inhibitor轉染組相較于control及NC組升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3B)。Western blot結果顯示,相較于control及NC組,miR-10a-5p inhibitor轉染組SGC-7901細胞中RORA蛋白表達水平升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3C)。

與control組及NC組相比,*P<0.05圖3 RORA是mir-10a-5p的靶基因Figure 3 RORA is the target gene of mir-10a-5p

2.4 轉染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細胞遷移能力的影響

為了解下調miR-10a-5p對SGC-7901細胞侵襲遷移能力的影響,實驗分為control組、NC組、miR-10a-5p inhibitor組,Transwell實驗結果顯示,轉染48 h時miR-10a-5p inhibitor組穿膜細胞數(shù)目顯著低于control組和NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖4)。結果表明,下調miR-10a-5p能抑制SGC-7901細胞侵襲、遷移能力。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖4 miR-10a-5p對胃癌細胞SGC-7901侵襲、遷移能力的影響 (×100)Figure 4 The effect of miR-10a-5p on invasion and migration abilities of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100)

2.5 轉染miR-10a-5p inhibitor對SGC-7901細胞增殖的影響

集落克隆結果顯示,相對于control組及NC組,miR-10a-5p inhibitor組集落形成數(shù)目下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5),證明下調miR-10a-5p可抑制SGC-7901細胞增殖能力。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖5 miR-10a-5p對胃癌細胞SGC-7901增殖能力的影響Figure 5 The effect of miR-10a-5p on the proliferation ability of gastric cancer cell SGC-7901

2.6 過表達RORA對SGC-7901侵襲、遷移能力的影響

Transwell實驗結果顯示,過表達RORA后48 h RORA過表達組穿膜細胞數(shù)少于control組和NC組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖6)。結果提示,過表達RORA能夠顯著抑制SGC-7901細胞侵襲、遷移能力。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖6 過表達RORA對胃癌細胞SGC-7901侵襲遷移能力的影響 (×100)Figure 6 Effect of overexpressing RORA on invasion and migration of gastric cancer cell line SGC-7901 (×100)

2.7 下調miR-10a-5p對SGC-7901細胞EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表達的影響

Western blot結果顯示,miR-10a-5p inhibitor組N-cadherin、Snail的蛋白表達低于control和NC組。相反,E-cadherin在miR-10a-5p inhibitor組中的表達高于control和NC組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖7)。

3 討論

目前,胃癌治療仍舊首選以手術為主的綜合治療,然而其死亡率仍舊較高,這與胃癌的復發(fā)與轉移有著密不可分的關系[13]。因此,尋找胃癌治療的新靶點,進而減少或者抑制侵襲與轉移是改善胃癌患者預后,提升患者生存率的重要條件。

近年來研究發(fā)現(xiàn)同時靶向關鍵調節(jié)基因和異常表達的miRNA可能是預防惡性腫瘤轉移的有效策略,因此miRNA可充當一種有效的分子靶向藥物對腫瘤進行治療[14]。據(jù)報道,miR-10a-5p在多種癌癥的發(fā)生進展中起著重要的作用。有研究證明miR-10a-5p在胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)中過表達并作為轉移形成的重要介質[15]。Yu等[16]發(fā)現(xiàn)miR-10a-5p在非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中呈過表達并靶向PTEN促進腫瘤的增殖、侵襲和遷移。Gao等[17]提出抑制miR-10a-5p可通過下調Akt途徑抑制膽管癌細胞的生長,而miR-10a-5p在胃癌中的表達及作用有待研究。

與control組及NC組比較,*P<0.05圖7 SGC-7901細胞下調miR-10a-5p對EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail蛋白表達的影響Figure 7 Effect of down-regulating miR-10a-5p on the expression of EMT-related proteins E-cadherin, N-cadherin and Snail in SGC-7901 cells

本實驗通過qRT-PCR檢測結果顯示,與正常人胃黏膜上皮細胞GES-1相比,miR-10a-5p在不同GC細胞中的表達量顯著上調。研究證明,miRNA參與腫瘤生物學行為取決于其下游靶點[18]。通過生物信息學軟件Target Scan預測RORA可能為miR-10a-5p的潛在靶基因。后續(xù)通過qRT-PCR及Western blot驗證結果顯示,轉染miR-10a-5p inhibitor可在蛋白水平及mRNA水平負向調控RORA。本研究集落克隆和Transwell實驗結果顯示,下調SGC-7901細胞中的miR-10a-5p能夠顯著抑制SGC-7901細胞的增殖、遷移與侵襲。然而其作用機制尚不清晰。同時,本研究在SGC-7901中過表達RORA發(fā)現(xiàn),過表達RORA可抑制胃癌細胞SGC-7901的侵襲與遷移能力。因此,我們認為miR-10a-5p能夠靶向RORA調控SGC-7901侵襲、遷移。RORA是孤兒受體ROR子家族的成員,在各種生物過程中(包括小腦發(fā)育,細胞增殖和晝夜節(jié)律控制)以及自身免疫、肥胖、腫瘤中充當核受體轉錄因子[19-21]。RORA已被報告在人胃癌組織與胃癌細胞系中低表達,而且RORA的減少與腫瘤進展和胃癌預后不良有關[22]。研究證明,在膠質瘤中RORA是miR-10a的靶基因,并通過激活NF-κB通路進一步增強髓系來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)活性[23]。

EMT(epithelial-mesenchymal transition,EMT)指上皮細胞特性逐漸消失,而逐漸表現(xiàn)出間質細胞特性的過程。研究證明,EMT與癌細胞的高侵襲性和轉移密切相關[24]。越來越多的證據(jù)表明miRNAs通過調節(jié)EMT過程,在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用,參與侵襲和轉移過程[25-27]。為了確定下調miR-10a-5p抑制SGC-7901細胞侵襲和遷移的機制,本研究采用Western blot法檢測下調miR-10a-5p后與EMT相關的蛋白E-cadherin、N-cadherin和Snail的表達,結果顯示,E-cadherin表達顯著升高,而N-cadherin、Snail表達顯著降低,提示下調miR-10a-5p可通過EMT途徑抑制胃癌細胞SGC-7901侵襲和轉移。

綜上所述,下調miR-10a-5p可通過上調靶基因RORA表達抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力,其機制為通過EMT途徑促進胃癌細胞侵襲和轉移,所以miR-10a-5p可能是胃癌治療的潛在分子靶點,因此在此基礎上探索新型核酸藥物的研發(fā),可能為胃癌的診斷和治療帶來積極的意義。