董征艷,王伊楠,郭宇航,張莉丹,王 科,劉 培,姚隆丹,段秀俊

(山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥劑學(xué)實驗室,晉中 030619;*通訊作者,E-mail:dxjzhyxy@163.com)

糖尿病(diabetes mellitus,DM),中醫(yī)謂之消渴,是一種由胰島素分泌不足和/或功能缺陷引起,以高血糖為特征的慢性進(jìn)展性代謝疾病[1]。隨著人們生活水平提高,飲食結(jié)構(gòu)改變,兼之經(jīng)常緊張焦慮,缺乏鍛煉等,DM已成現(xiàn)在常見多發(fā)病,目前中國DM患者約有1.14億,占全世界糖尿病27%左右[2],2018年版《國家基本藥物目錄》重點聚焦慢性病,DM就位列其中。糖尿病不可怕,可怕的是由于長期高血糖導(dǎo)致的高滲血液引起的各種大血管、微血管受損,進(jìn)而危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等,產(chǎn)生各種并發(fā)癥。L悄蠆死亡者有一半以上是心腦血管所致,10%是腎病變所致。糖尿病腎病(DN)的發(fā)生除了高血糖外,血液流變學(xué)異常、足細(xì)胞病變、糖基化總產(chǎn)物作用、氧化應(yīng)激損傷內(nèi)皮等因素也是導(dǎo)致糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病屬本虛標(biāo)實,本虛主要指脾肺腎三臟虧虛,標(biāo)實指痰飲水濕集聚,瘀血停滯[4-6]。唐英等[7]認(rèn)為脾虛與糖尿病腎病的發(fā)生有著密切的關(guān)系,長期飲食肥甘肉厚,飲食失節(jié)損傷脾胃,脾失健運,不能及時消化吸收水谷精微,隨尿液排出,從而出現(xiàn)尿濁。

健脾經(jīng)方四君子湯古來有用之治消渴者,如金元四大家之張元素[8],現(xiàn)在臨床也有加減治療DM的研究報道[9,10]。項目組的前期研究結(jié)果表明健脾益氣經(jīng)方四君子湯具有明顯的降血糖作用,其對糖尿病所致腎損傷的影響研究未見報道,但從病機看糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展與脾虛密切相關(guān)。鑒于糖尿病腎病在糖尿病并發(fā)癥中的常見性及重大危害性,本實驗研究了四君子湯對糖尿病腎損傷的干預(yù)作用。實驗通過考察四君子湯不同提取物對糖尿病大鼠的體征、尿量、腎系數(shù)、血清生化指標(biāo)及病理切片等多個方面的影響,較為全面地評價健脾益氣經(jīng)方四君子湯抗糖尿病腎損傷的作用,以期拓展四君子湯的臨床應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 藥材與藥品

黨參(批號180103)、白術(shù)(批號181201)、茯苓(批號181201)、甘草(批號181103)均購自山西維康堂中藥飲片有限公司,經(jīng)山西中醫(yī)大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品,均符合2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。蔗糖(批號20190917)購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;膽固醇(Lot. No.624J031)購自北京索萊寶生物科技有限公司;牛膽酸鈉(Lot No.723E051)購自北京索萊寶生物科技有限公司;鹽酸二甲雙胍腸溶片(批號71808232)購自河北天成藥業(yè)股份有限公司;尿蛋白定量試劑盒(批號:20190103)、尿素氮(BUN)試劑盒(脲酶法)(批號2019030)均購自南京建成生物工程研究所;Mouse UCR ELISA KIT(CK-E2053)購自上海研吉生物科技有限公司;組織固定液(Lot No.14J26C68),購自武漢博士德生物公司;鏈脲佐菌素(STZ)(批號S8050)購于美國Sigma公司,稱取STZ,加檸檬酸緩沖液將配制成20 mg/ml,即得STZ溶液;檸檬酸(批號:20180409)、檸檬酸鈉(批號:20151020),均購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司,分別稱取檸檬酸2.1 g、檸檬酸鈉2.94 g置于100 ml容量瓶中加蒸餾水溶解至刻度,用時將兩種溶液按一定比例混合,將pH值調(diào)節(jié)至4.2-4.5[11],即得檸檬酸緩沖溶液;水合氯醛(批號:20180110),購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,稱取10 g水合氯醛置于100 ml容量瓶中加蒸餾水溶解至刻度,即得10%水合氯醛。

1.2 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠70只,體質(zhì)量(20±13.5)g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司,許可證號SCXK(滬)2018-0006。

1.3 實驗儀器

DNM-9602酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司),三諾安穩(wěn)血糖儀(產(chǎn)品注冊證編號:201724000323)以及配套試紙購于三諾生物傳感股份有限公司,DZF-6020真空干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),TGL18M型離心機(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司),HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市杰瑞爾電器有限公司),96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(海門市晶曠實驗器材廠),移液槍(上海盛創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司臺州分公司)。

1.4 溶液的制備

1.4.1 四君子湯(SJZT)水提液 按處方比例(黨參 ∶茯苓 ∶白術(shù) ∶甘草=9 ∶9 ∶9 ∶6)稱取飲片適量,煎煮兩次,第一次加10倍量水,回流提取60 min,第二次加8倍量水,回流提取45 min,合并2次煎液,濃縮,減壓干燥得干浸膏。取干浸膏粉,加蒸餾水溶解,制成每1 ml相當(dāng)于原生藥量0.566 g的溶液,即得。

1.4.2 四君子湯(SJZT)水提醇沉液 將按“1.4.1”項下方法制得的水煎液,濃縮至每1 ml相當(dāng)于原藥材1 g,加乙醇使藥液的含醇量達(dá)到75%,靜置12 h,3 000 r/min離心15 min,取上清液,回收乙醇,濃縮,減壓干燥得干浸膏。取干浸膏粉,加蒸餾水溶解,制成每1 ml相當(dāng)于原生藥量0.566 g的溶液,即得。

1.4.3 四君子湯(SJZT)水提醇沉物 取“1.4.2”項下離心后所得沉淀物,減壓干燥得干浸膏。取干浸膏粉,加蒸餾水溶解,制成每1 ml相當(dāng)于原生藥量0.566 g的溶液,即得。

1.4.4 陽性藥液 取鹽酸二甲雙胍腸溶片,除去腸溶衣,研細(xì),取粉末適量,加蒸餾水溶解,制成0.003 g/ml的溶液,即得。

1.5 造模

SPF級雄性SD大鼠70只,隨機選取其中9只作為空白對照組,空白對照組用普通飼料喂養(yǎng);其余61只大鼠高糖高脂飼料(基礎(chǔ)飼料58.5%,膽固醇1%,蛋黃粉10%,蔗糖20%,豬油10%,膽酸鈉0.5%)喂養(yǎng)4周。4周后隔夜禁食不禁水12 h,腹腔注射STZ 40 mg/kg(空白組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖溶液),72 h后禁食12 h,斷尾取血測空腹血糖,血糖值≥11.1 mmol/L造成糖尿病模型[11]。

1.6 分組與給藥

將造模成功的45只大鼠隨機分為模型組、陽性藥組、四君子湯水提液組、四君子湯水提醇沉物組、四君子湯水提醇沉液組,每組9只大鼠?？瞻捉M和模型組大鼠以10 ml/kg灌胃(ig)蒸餾水,其余各組大鼠以10 ml/kg分別灌胃(ig)相應(yīng)受試藥物,每天1次,連續(xù)給藥28 d。期間空白組以正常飼料喂養(yǎng),其余各組均繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.7 觀察指標(biāo)及檢測方法

給藥期間每日觀察大鼠飲食、活動、毛色等基本狀況,每周測定體質(zhì)量。末次給藥后,收集大鼠24 h尿液,并采用斷尾法取血測定血糖(FBG);之后將大鼠用10%水合氯醛麻醉,腹主動脈取血,離心分離血清,分裝存放于-80 ℃冰箱。取出腎臟組織,組織固定液固定24 h,HE染色,置光學(xué)顯微鏡(×200)下觀察各組大鼠的腎臟組織變化情況,記錄腎系數(shù)(腎臟重量/大鼠體質(zhì)量×100%)。取收集到的尿液,按試劑盒檢測方法檢測24 h尿蛋白(PRO);取凍存的血清,按試劑盒檢測方法檢測尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法

2 結(jié)果

2.1 對大鼠體征的影響

表1可見,模型組的毛色、活動及反應(yīng)均明顯區(qū)別于與空白組,但各給藥組均可改善由于高血糖導(dǎo)致的大鼠的行為異常。由表2可見,當(dāng)?shù)?周注射完STZ后,空白組體質(zhì)量繼續(xù)上升,其余各組大鼠體質(zhì)量下降。與空白組比較,模型組大鼠體質(zhì)量在第5,6周明顯下降(P<0.05),在第7,8周顯著下降(P<0.01)。與模型組相比,各給藥組體質(zhì)量無顯著性差異。不同給藥組間比較也無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 四君子湯不同提取物對大鼠一般行為學(xué)的影響

表2 四君子湯不同提取物對大鼠體質(zhì)量變化的影響

2.2 對大鼠尿量和腎系數(shù)的影響

由表3可見,與空白組比較,模型組大鼠尿量及腎系數(shù)顯著增加(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組尿量及腎系數(shù)顯著降低(P<0.01),SJZT水提醇沉物組尿量明顯降低(P<0.05)。與陽性藥組比較,其余各給藥組腎系數(shù)明顯升高(P<0.05)。

表3 四君子湯不同提取物對大鼠尿量和腎系數(shù)的影響

2.3 對大鼠血清生化指標(biāo)FBG、urine protein、SCr、BUN的影響

由表4可見,與空白組比較,模型組大鼠FBG、SCr、BUN顯著升高(P<0.01),尿蛋白明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,陽性藥組FBG、尿蛋白、SCr、BUN顯著降低(P<0.01),SJZT水提液組FBG、尿蛋白、SCr顯著降低(P<0.01),BUN明顯降低(P<0.05),SJZT水提醇沉物組SCr、BUN明顯降低(P<0.05)。與陽性藥組比較,SJZT水提液組SCr、BUN顯著升高(P<0.01),SJZT水提醇沉物組及SJZT水提醇沉液組各指標(biāo)均顯著升高(P<0.01)。與SJZT水提液組比較,SJZT水提醇沉物組FBG、SCr明顯升高(P<0.05),SJZT水提醇沉液組urine protein顯著升高(P<0.01),FBG 、SCr明顯升高(P<0.05)。

表4 四君子湯不同提取物對大鼠生化指標(biāo)的影響

2.4 對大鼠腎組織病理切片的影響

與空白組比較,模型組的腎小球基底膜明顯增厚,此外沒有出現(xiàn)明顯的腎小球系膜基質(zhì)增生、腎小管管腔擴張、腎組織炎性細(xì)胞浸潤等腎損傷的明顯病理改變;與模型組比較,各給藥組均明顯改善了腎小球基底膜的增厚現(xiàn)象(見圖1)。

圖1 四君子湯不同提取物干預(yù)的糖尿病大鼠腎組織HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of renal tissue in diabetic rats after treated with different extracts of Sijunzi decoction (×200)

3 討論

3.1 四君子湯不同提取物的選擇依據(jù)

四君子湯傳統(tǒng)是取水煎煮的湯液,實驗比較了四君子湯全方水煎液、四君子湯水提醇沉液、四君子湯水提醇沉物各自的抗糖尿病腎損傷作用,其中全方水煎液中含有了大分子與小分子物質(zhì),水提醇沉液基本含有小分子物質(zhì),醇沉物基本包括大分子物質(zhì),實驗通過考察四君子湯此3個不同部位的藥效作用,可以為以后制劑研究中的工藝設(shè)計提供實驗依據(jù)。

3.2 腎功能評價指標(biāo)的選擇依據(jù)

除體征及病理切片外,實驗主要選擇了4項血清生化指標(biāo)[空腹血糖(FBG)、蛋白尿(PRO)、肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)]及尿量與腎系數(shù)作為實驗主要考察指標(biāo)。

糖尿病腎病早期會出現(xiàn)腎小球損害,腎小球濾過膜的通透性增加,出現(xiàn)了蛋白尿(PRO)[12];肌酐(SCr)是肌肉中的代謝產(chǎn)物,尿素氮(BUN)是機體蛋白質(zhì)代謝的最終產(chǎn)物,二者均作為機體代謝廢物由腎小球濾過排出體外,如果腎臟損傷,不能將其及時排出,會在體內(nèi)集聚,使血清中水平升高[13];高血糖可嚴(yán)重?fù)p傷微小血管或毛細(xì)血管內(nèi)壁,導(dǎo)致腎毛細(xì)血管淤堵,加劇腎臟的負(fù)擔(dān),加速腎功能衰竭,血糖現(xiàn)在也是腎功能評價指標(biāo)之一。故本實驗選擇PRO、SCr、BUN、FBG作為考察指標(biāo)。

此外尿量可以綜合評價腎小球的濾過及腎小管的重吸收功能,而腎系數(shù)是衡量腎臟肥大的客觀指標(biāo),可用來佐證腎臟組織病理改變[14],故實驗同時將尿量及腎系數(shù)作為實驗評價指標(biāo)。

3.3 基于血清生化指標(biāo)的實驗結(jié)果分析

從實驗結(jié)果看,相較于空白組,模型組FBG、SCr、BUN、PRO均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明從生化指標(biāo)的角度看,糖尿病持續(xù)4周可以造成較大程度的腎損傷。相較于模型組,陽性藥組FBG、SCr、BUN、PRO均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明二甲雙胍可以顯著改善糖尿病所致的腎損傷;四君子湯水提液組FBG、SCr、BUN、PRO均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明四君子湯水提液可以明顯改善糖尿病所致的腎損傷,這也為四君子湯臨床用于抗糖尿病腎損傷提供了一定的實驗依據(jù);四君子湯水提醇沉物組SCr、BUN明顯降低(P<0.05),其FBG、PRO及水提醇沉液組四個生化指標(biāo)均呈現(xiàn)良好的改善趨勢,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。相較于陽性藥組,四君子湯水提液組FBG、PRO有一定程度升高,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。實驗結(jié)果顯示四君子湯用于抗糖尿病腎損傷以全方水煎煮為佳,其水溶性大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)均具有一定的抗糖尿病腎損傷作用與模型組比較有了統(tǒng)計學(xué)差異,這也為該方以后可能的制劑開發(fā)提供一定的參考。

3.4 基于體質(zhì)量、尿量及腎系數(shù)的實驗結(jié)果分析

從實驗結(jié)果看,模型組相較于空白組,體質(zhì)量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,與現(xiàn)實生活中的糖尿病患者“三多一少”中的體質(zhì)量減輕的癥狀相吻合。體質(zhì)量減輕有利有弊,可以降低身體負(fù)荷,改善胰島素抵抗,但體質(zhì)量過度減輕會使人營養(yǎng)不良,免疫力降低。關(guān)于糖尿病患者體質(zhì)量減輕的機制目前尚不明確,為項目可能的后續(xù)研究提供一定思路。

模型組相較于空白組,尿量、腎系數(shù)顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明糖尿病大鼠持續(xù)4周可以造成較大程度的腎損傷。相較于模型組,陽性藥組尿量、腎系數(shù)均顯著改善,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,說明二甲雙胍可以顯著改善糖尿病所致的腎損傷,四君子湯水提醇沉物組尿量明顯降低(P<0.05),其他給藥組尿量及腎系數(shù)均有一定程度降低,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。與陽性藥組比較,其余各給藥組腎系數(shù)明顯升高(P<0.05),尿量有一定程度升高。但無統(tǒng)計學(xué)差異。實驗結(jié)果顯示四君子湯具有一定的干預(yù)2型糖尿病腎損傷的作用,其中四君子湯水提液作用更加明顯,但就尿量及腎系數(shù)而言不及二甲雙胍。

3.5 基于腎實質(zhì)的實驗結(jié)果分析

糖尿病腎病是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一[15],其主要病變特征為腎小管肥大,基底膜增厚、系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)積聚以及腎小球、腎小管纖維化等[16-17],進(jìn)一步發(fā)展,會導(dǎo)致腎衰竭,嚴(yán)重影響患者的生活,甚至威脅患者生命。從模型組病理切片的實驗結(jié)果看,糖尿病大鼠造模成功后,維持高糖高脂喂養(yǎng)4周,除基底膜增厚明顯外,其他并未見明顯異常,說明從器官實質(zhì)情況看,實驗期間并未對造成明顯腎損傷。此外各給藥組與模型組比較均明顯改善了腎小球基底膜的增厚現(xiàn)象,說明不管是二甲雙胍還是四君子湯均具有一定的腎保護(hù)作用,而作用機制有待于進(jìn)一步研究。

3.6 四君子湯抗Ⅱ型糖尿病腎損傷的部位綜合分析

四君子湯不同提取物均能夠降低血糖,減少尿蛋白排泄,具有一定的干預(yù)2型糖尿病腎損傷作用,其中四君子湯水提液改善糖尿病所致的腎損傷作用更明顯。提示四君子湯用于抗糖尿病腎損傷以全方水煎煮為佳,其水溶性大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)均具有一定的干預(yù)糖尿病腎損傷作用。本實驗結(jié)果可為四君子湯干預(yù)糖尿病腎損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供參考,同時也為其干預(yù)糖尿病腎損傷的臨床調(diào)劑用藥及制劑研發(fā)的工藝原則提供實驗依據(jù)。

3.7 鹽酸二甲雙胍與四君子湯的效果比較分析

鹽酸二甲雙胍作為價格便宜、經(jīng)濟實惠、效果顯著的傳統(tǒng)一線降糖藥,實驗結(jié)果顯示其在干預(yù)糖尿病腎損傷方面作用明顯,這也為拓寬鹽酸二甲雙胍的臨床應(yīng)用范圍,用于抗糖尿病腎病提供了一定的實驗依據(jù)。從生化指標(biāo)的檢測結(jié)果看,四君子湯水提液組4項指標(biāo)均明顯優(yōu)于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,但不及鹽酸二甲雙胍組。作為中藥復(fù)方,畢竟成分復(fù)雜,且活性成分的服用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及化學(xué)藥,雖說從生化指標(biāo)的角度不及鹽酸二甲雙胍,但中藥具有的配伍作用更利于發(fā)揮多靶點、多途徑的治療作用,且毒副作用不明顯,所以四君子湯的抗糖尿病腎損傷作用也很值得肯定。