張 旭,夏圻兒,徐 杰

(上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院泌尿外科,上海 201299;*通訊作者,E-mail:uro-zhang@163.com)

蘇木屬豆科云實屬植物,為傳統(tǒng)中藥材,臨床上具有祛痰、止痛、活血、散風(fēng)、鎮(zhèn)靜等功效,并有一定的抗癌作用。蘇木心材的水提物稱為蘇木素(hematoxylin),其主要成分為巴西蘇木素[1]。作為天然色素,廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、日化工業(yè)、皮革及織物染色等行業(yè)[2],也是細胞學(xué)中常用的染色劑。對蘇木素的研究表明[3,4],其在體外及體內(nèi)實驗中對K562、HL-60、P815、L929、Yac-1等腫瘤細胞均有顯著的殺傷活性,在局部大劑量給藥時可以使S180、EAC、H22、P388、L1210等荷瘤動物生存期顯著延長。本課題組曾觀察到蘇木素在較低濃度下能誘導(dǎo)T24細胞發(fā)生凋亡,為進一步探討其機制,進行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇木素(美國Amresco公司,分子式:C16H14O6·3H2O,相對分子質(zhì)量356.33),以生理鹽水配置為2%的溶液,高壓蒸氣滅菌備用;膀胱癌T24細胞(上海中科院);細胞培養(yǎng)基RPMI-1640、胎牛血清(美國Gibco公司);四甲基偶氮唑鹽(MTT);碘化丙啶(PI)和異硫氰酸熒光素(FITC)均為美國sigma公司;CO2培養(yǎng)箱(美國BINDER公司);倒置顯微鏡(日本Olympus公司);FACS流式細胞儀(美國BD公司);RT-PCR儀(美國BIO-RAD公司);透射電子顯微鏡(荷蘭FEI TECNAI G2 12型)。

1.2 方法

1.2.1 T24細胞培養(yǎng) T24細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 mg/ml鏈霉素)37 ℃,5% CO2濃度下培養(yǎng)24 h。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.2.2 MTT實驗 配制0.05%、0.1%和0.2%工作濃度蘇木素;分別在37 ℃,5% CO2濃度下培養(yǎng)2,12,24 h;加MTT,繼續(xù)孵育4 h;吸棄細胞培養(yǎng)上清液,每孔加入150 μl DMSO,震蕩10-15 min以溶解結(jié)晶。在490 nm測定每孔的吸光度(OD)值。

1.2.3 透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)改變 取生長狀態(tài)良好的細胞約106,0.2%蘇木素處理24 h后,胰酶消化貼壁的T24細胞并使用2.5%的戊二醛固定細胞,透射電鏡觀察。

1.2.4 線粒體DNA(mtDNA)突變檢測

1.2.4.1 mtDNA HV1和HV2區(qū)引物設(shè)計 在美國國立生物技術(shù)信息中心獲取mtDNA全長序列(全長16 569 bp),通過查閱文獻的方式找到mtDNA的HV1(16 001-16 569 bp)和HV2(1-574 bp)兩個高變區(qū)(HV1和HV2高變區(qū)序列),使用Premier 5軟件在HV1和HV2的兩端設(shè)計引物以保證跨過完整的HV1和HV2區(qū),引物設(shè)計策略(見圖1)。

圖1 mtDNA HV1和HV2區(qū)引物設(shè)計示意圖Figure 1 Primer design in HV1 and HV2 region of mtDNA

1.2.4.2 T24細胞總DNA的提取 正常培養(yǎng)24 h后加入0.2%蘇木素,每個設(shè)置3個復(fù)孔,加藥后處理24 h。不含蘇木素的T24細胞(空白對照組)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集最多不超過5×106個細胞,清除RNA,加入蛋白酶K、裂解液,加入DNA純化柱內(nèi),所得總DNA進行測序。

1.2.5 RT-PCR定量檢測細胞色素C、caspase-3和caspase-9的表達

用TRIzol法提取細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,1%瓊脂糖凝膠電泳分離基因片段,BioRad.iQ5 Bandscan軟件分析基因表達水平。

實時定量PCR體系:2×UltraSYBR Mixture 25 μl,Forward Primer(10 μmol/L) 1 μl,Reverse Primer(10 μmol/L)1 μl,Template DNA 1 μl,RNase-Free Water 22 μl。PCR反應(yīng)程序(兩步法PCR):預(yù)變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 15 s,退火/延伸60 ℃ 1 min,40個循環(huán)。融解曲線分析:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件,MTT實驗中兩組間的OD值均數(shù)比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT實驗結(jié)果

將凍存管中的T24細胞懸浮液加入到培養(yǎng)瓶中,37 ℃,5% CO2濃度下培養(yǎng)24 h,細胞生長狀態(tài)良好(見圖2)。由表1可知:在蘇木素處理2 h后,0.05%和0.1%蘇木素對T24細胞無明顯抑制,而0.2%蘇木素抑制明顯;處理12 h和24 h后,0.05%,0.1%,0.2%蘇木素均抑制明顯。因此,蘇木素對T24腫瘤細胞的生長抑制作用隨蘇木素濃度的增加及作用時間延長而增強。

圖2 正常生長的T24細胞 (×200)Figure 2 Normal growth of T24 cells (×200)

表1 不同濃度的蘇木素處理2,12,24 h后T24細胞MTT實驗吸光度值比較

2.2 透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結(jié)構(gòu)改變

0.2%蘇木素處理T24腫瘤細胞24 h后,細胞形態(tài)不規(guī)則,細胞核深染,染色質(zhì)呈塊狀凝集,胞漿內(nèi)出現(xiàn)空洞,線粒體較少,部分細胞器破壞,細胞膜有缺損現(xiàn)象(見圖3)。

圖3 蘇木素處理T24細胞24 h后的超微結(jié)構(gòu)改變 (透射電鏡,×25 000)Figure 3 Ultrastructural changes of T24 cells treated with hematoxylin for 24 h (TEM,×25 000)

2.3 線粒體DNA突變檢測

經(jīng)過0.2%蘇木素處理后,mtDNA HV1和HV2兩個高變區(qū)位點均未發(fā)生突變。

2.4 RT-PCR定量檢測細胞色素C、caspase-3和caspase-9的表達

使用2-ΔΔCt法進行相對定量分析,結(jié)果顯示經(jīng)過0.2%蘇木素處理24 h后腫瘤細胞中細胞色素C的表達水平提高了1.16倍。caspase-3的表達水平提高了3.23倍,caspase-9的表達水平提高了7.94倍(見表2)。

表2 0.2%蘇木素處理24 h后T24細胞的細胞色素C、caspase-3、caspase-9的表達水平

3 討論

細胞凋亡和細胞增殖都是生命的基本現(xiàn)象,是維持體內(nèi)細胞數(shù)量動態(tài)平衡的基本措施。細胞凋亡的途徑主要有兩條,一條是通過胞外信號激活細胞內(nèi)的凋亡酶caspase、一條是通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase。這些活化的caspase可將細胞內(nèi)的重要蛋白降解,引起細胞凋亡。

Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶,相當(dāng)于線蟲中的ced-3,這些蛋白酶是引起細胞凋亡的關(guān)鍵酶,一旦被信號途徑激活,能將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解,使細胞不可逆的走向死亡。Caspase分為兩類[5]:一類為執(zhí)行者(executioner或effector),如caspase-3、6、7,它們可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,引起凋亡,但不能通過自催化(autocatalytic)或自剪接的方式激活;另一類為啟動者(initiator),如caspase-8、9,能通過自剪接而激活,然后引起caspase級聯(lián)反應(yīng),如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7。細胞應(yīng)激反應(yīng)或凋亡信號能引起線粒體細胞色素C釋放,作為凋亡誘導(dǎo)因子,細胞色素C能與Apaf-1、caspase-9前體、ATP/dATP形成凋亡體,然后召集并激活caspase-3,進而引發(fā)caspases級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細胞凋亡[6,7]。

本研究結(jié)果顯示,蘇木素處理24 h后,T24細胞形態(tài)不規(guī)則,細胞核深染,染色質(zhì)呈塊狀凝集,胞漿內(nèi)出現(xiàn)空洞,線粒體較少,部分細胞器破壞,細胞膜有缺損現(xiàn)象,證明其具有誘導(dǎo)T24細胞凋亡的作用。從MTT檢測結(jié)果可知,蘇木素對T24腫瘤細胞的誘導(dǎo)凋亡作用隨蘇木素濃度的增加而增強。在蘇木素處理T24細胞2 h后,0.05%和0.1%蘇木素組誘導(dǎo)凋亡的強度無明顯的差異,在0.2%蘇木素處理組效果顯著;處理12 h后,0.05%及0.1%蘇木素組亦有顯效;處理24 h后,0.05%,0.1%,0.2%蘇木素均明顯誘導(dǎo)凋亡。RT-PCR檢測到細胞色素C表達表達水平提高了1.16倍,證明其已進入胞漿。有研究認為胞質(zhì)細胞色素C含量與細胞早期凋亡率呈正相關(guān)[8]。而0.2%蘇木素處理24 h后caspase-9的表達水平提高了7.94倍,表明casperse-9前體與凋亡酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf1)、細胞色素C、ATP/dATP形成凋亡小體增加,從而啟動凋亡,使caspase-3的表達水平提高了3.23倍,并被激活,導(dǎo)致T24細胞凋亡。

線粒體凋亡是一種精確調(diào)控的細胞死亡形式,通過靶向癌細胞發(fā)揮腫瘤抑制機制的作用。線粒體脂質(zhì),如心磷脂、神經(jīng)酰胺和鞘氨醇-1-磷酸,通過與吞噬細胞的機械作用,作為清除受損線粒體的有絲分裂信號,通過細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中激活線粒體凋亡[9]。

本研究結(jié)果表明隨著蘇木素濃度的提高,它誘導(dǎo)膀胱癌細胞凋亡的能力增強,其并未通過導(dǎo)致線粒體DNA發(fā)生變化而啟動凋亡,而是通過使線粒體中的細胞色素C釋放到細胞質(zhì)中,引發(fā)caspases級聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致T24細胞凋亡。