黃海艷 ，杜娟 ，張杰 ，鄒彥芬 ，彭曦 ，王芳 ，于波 ，邵勇

（1.北京大學深圳醫(yī)院，廣東深圳518036；2.北京大學人民醫(yī)院，北京100044）

白癜風是一種獲得性進行性的色素脫失性皮膚病，以局部表皮功能性黑素細胞缺失為主要特征，全世界的發(fā)病率大約在0.5%～1%[1]。最新的研究結果發(fā)現，紫鉚素及其衍生物可以抑制小鼠脾淋巴細胞的免疫功能，促進小鼠B16黑素瘤細胞和正常人黑素細胞黑素合成，但其具體分子機制尚不清楚[2-4]。有研究發(fā)現，AMPK通路在調節(jié)黑素生成過程中發(fā)揮著重要作用[5]，因此，本研究將紫鉚素作用于正常人黑素PIG1細胞，觀察紫鉚素對體外黑素合成的影響及其分子機制，為探討紫鉚素對白癜風的治療作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 試劑 紫鉚素（#F4043），α-黑素細胞刺激素（MSH）購自美國Sigma公司；胰島素、氫化可的松、L-谷氨酰胺、L-Dopa（Sigma，美國）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所；抗 β-actin、MITF、TRP-1、TRP-2、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和P-AMPK抗體購自（Abcam，英國）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔二抗和鼠二抗購自美國CST公司；ECL發(fā)光液（Millipore，美國）；其他試劑均為分析純（南京化學試劑有限公司）；AICAR（#HY-13417）購自上海MCE公司。

1.1.2 儀器 生物安全柜（AC2-4S1型）、CO2培養(yǎng)箱（Celmate型）購自新加坡Esco公司；CKX71倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；BS210S分析天平購自德國Sartorius公司；Varoskan Flash多功能酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；Milli-Q純水儀購自美國Millipore公司；Tanon-5200全自動化學發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)購自上海天能。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 正常人黑素細胞系PIG1細胞，來源于正常人黑素細胞，基本生物學特性與正常人原代培養(yǎng)黑素細胞相似。由美國芝加哥大學Caroline Le Poole博士惠贈[6]。復蘇PIG1黑素細胞，加入含人黑素細胞生長添加劑HMGS及5%FBS的M254培養(yǎng)基，孵箱內培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化傳代，細胞增殖良好，至80%左右融合時進行實驗，光鏡下細胞呈樹突狀為生長良好。

1.2.2 分組及給藥 實驗分組：對照組，α-MSH組（300 nmol/L），紫鉚素低（10 nmol/L）、紫鉚素中（100 nmol/L）、紫鉚素高（1 μmol/L）劑量組，細胞加入藥物刺激后完全培養(yǎng)48 h。在檢測AMPK通路對黑素合成影響的實驗中，先給與1 μM AICAR處理細胞4 h后，再給與各種藥物處理48 h。

1.2.3 CCK-8法檢測紫鉚素對PIG1細胞活力的影響 選擇對數生長期的PIG1細胞，胰酶消化，調整細胞密度為0.5×106/mL接種于96孔板，每孔100μL。過夜培養(yǎng)后按2.2加入藥物培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8孵育2 h后，562 nm檢測吸光度。

1.2.4 LDH釋放法檢測紫鉚素對PIG1細胞的毒性選擇對數生長期的PIG1細胞，胰酶消化，調整細胞密度為0.5×106/mL接種于24孔板，每孔100 μL。按1.2.2加入藥物培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基，按照乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒說明測定上清液中的LDH活性，在490 nm處測定吸光度。

1.2.5 NaOH裂解法檢測PIG1細胞黑素含量 選擇對數生長期的PIG1細胞，胰酶消化，調整細胞密度為1.0×106/mL接種于6孔板，按1.2.2加入藥物培養(yǎng)48 h后，每孔加入100 μL總蛋白抽提裂解液進行勻漿，加入2倍體積的抽提液混勻。4℃，12 000轉/min離心10 min。溶液分上中下3層，上層棄去，中間層蛋白膜用于蛋白定量（BCA）法。下層黑素沉淀加入 350 μL 1 mol/L NaOH（含 10%DMSO），80 ℃裂解2 h，于405 nm處測定OD值，計算黑素相對含量。

1.2.6 L-Dopa氧化法檢測人皮膚組織酪氨酸酶（TYR）活力 選擇對數生長期的PIG1細胞，胰酶消化，調整細胞密度為0.5×106/mL接種于6孔板，每孔加入100 μL總蛋白抽提裂解液進行勻漿，加入2倍體積的抽提液混勻，4℃，12 000轉/min離心10 min。溶液分上中下3層，取中間層蛋白膜用于蛋白定量（BCA）法。計算含10μg總蛋白的裂解液體積，用PBS（0.1 mol/L，pH 6.8）定量至 100 μL，再加入 100 μL 0.01%L-Dopa，37℃避光孵育 30 min，475 nm 處測定OD值。

1.2.7 Western blot法檢測黑素相關蛋白的表達 用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法蛋白濃度定量，經SDS-PAGE電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗在4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗滌3次，ECL化學發(fā)光法顯影，拍照。

1.2.8 RT-PCR 用Trizol提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，最后進行RT-qPCR檢測。以GAPDH為內參計算mRNA相對表達量，引物序列為：

GAPDH 上游引物：5’-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3’，下游引物：5’-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3’；MITF 上游引物：5’-GCCTGTCTCGGGAAACTTGA-3’，下游引物：5’-ACGCTGTGAGCTCCCTTTTT-3’；TRY 上游引物：5’-CGAGTCGGATCTGGTCATGG-3’，下游引物：5’-GACACAGCAAGCTCACAAGC-3’。

PCR反應體系為10 μL。反應條件：95℃變性60 s，60℃退火 50 s，72℃延伸 60 s，擴增 40個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。

1.3 統(tǒng)計學處理 所有實驗結果采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件分析，數據采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫鉚素對PIG1細胞活性的影響 CCK-8檢測PIG1細胞活力結果顯示，300 nmol/L α-MSH能上調 PIG1細胞活力至（1.89±0.32）倍（P=0.025），100 nmol/L和1 μmol/L紫鉚素能上調PIG1細胞活力至（1.45±0.22）倍（P=0.021）和（1.90±0.31）倍（P=0.032），不同濃度紫鉚素促進PIG1細胞增殖作用還呈劑量依賴性。與對照組相比，300 nmol/L α-MSH和不同濃度的紫鉚素作用48hPIG1細胞釋放的LDH差異無統(tǒng)計學意義。結果顯示，α-MSH和紫鉚素能促進PIG1細胞增殖，且不造成細胞毒性，見圖1。

圖1 α-MSH和紫鉚素對PIG1細胞活力和LDH釋放的影響

2.2 紫鉚素對PIG1細胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響 與對照組相比，300 nmol/L α-MSH，100 nmol/L和1 μmol/L紫鉚素作用48 h后，PIG1細胞黑色素含量分別上調（1.49±0.09）倍（P=0.009），（1.35±0.22）倍（P=0.027）和（1.59±0.11）倍（P=0.031），酪氨酸酶活力分別上調（1.29±0.08）倍（P=0.014），（1.15±0.17）倍（P=0.015）和（1.28±0.13）倍（P=0.015）。見圖2。

圖2 α-MSH和紫鉚素對PIG1細胞黑色素含量和酪氨酸酶活性的影響

2.3 紫鉚素對PIG1細胞黑素合成相關蛋白和mRNA表達的影響 MITF是黑素合成的關鍵轉錄因子，并能調控黑素相關蛋白TRP-1和TRP-2的表達。與對照組相比，α-MSH能顯著上調MITF、TRP1和TRP2的蛋白和mRNA表達水平，紫鉚素劑量依賴性的促進MITF和TRP-1、TRP-2的蛋白和mRNA表達水平。結果顯示，α-MSH通過上調TYR活力及MITF調控的黑素相關蛋白的表達促進細胞黑素合成，見圖3。

圖3 α-MSH和紫鉚素對PIG1細胞黑素相關蛋白（MITF、TRP-1、TRP-2）及其 mRNA 表達的影響

2.4 α-MSH和紫鉚素抑制PIG1細胞AMPK通路 AMPK是調節(jié)黑素生成的重要激酶。結果顯示，與對照組相比，300 nmol/L α-MSH和紫鉚素能劑量依賴性地抑制AMPK的磷酸化水平，見圖4。

圖4 α-MSH和紫鉚素對PIG1細胞AMPK通路的影響

2.5 紫鉚素通過AMPK通路調節(jié)PIG1細胞黑素合成相關蛋白和mRNA表達 AICAR是AMPK通路特異性激動劑，能顯著刺激AMPK的磷酸化水平。1 μmol/L AICAR能顯著抑制α-MSH和紫鉚素對PIG1細胞MITF、TRP1和TRP2蛋白水平的上調作用，并抑制MITF和TRY的mRNA表達水平。結果表明，α-MSH和紫鉚素都可通過AMPK通路調節(jié)PIG1細胞黑素合成途徑。見圖5。

2.6 AMPK通路激動劑對PIG1細胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響 結果顯示，用AICAR激活PIG1細胞AMPK通路，能夠顯著抑制α-MSH和紫鉚素誘導的PIG1細胞黑素合成增加和酪氨酸酶活性上調作用。結果表明，α-MSH和紫鉚素可以通過AMPK通路促進PIG1細胞黑素合成，見圖6。

3 討論

圖5 AICAR對PIG1細胞黑素合成相關蛋白及其mRNA表達的影響

圖6 AICAR對PIG1細胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影響

白癜風是一種常見的色素脫失性疾病，由于其確切的病因尚未找到，目前還沒有一種完全有效的治療方法。紫鉚素是從菊科植物驅蟲斑鳩菊（Vernonia Anthelmintica Willd）的成熟果實中提取的一種黃酮類成分，紫鉚素及其衍生物有抑制免疫、促進黑色素合成的作用[7-8]，然而具體機制仍不清楚。本研究通過培養(yǎng)正常人黑素細胞PIG1，探討紫鉚素對皮膚黑素合成功能的影響及可能的作用機制。

首先，筆者觀察了紫鉚素對PIG1細胞潛在的毒性作用。300 nM α-MSH及不同劑量的紫鉚素作用PIG1細胞后，可促進細胞增殖，但對LDH釋放量無顯著影響，見圖1，這表明該研究劑量下的紫鉚素對PIG1有增殖促進作用，且不引起毒性。

為了探討紫鉚素促進PIG1細胞黑素合成的分子機制，筆者檢測了紫鉚素對黑素合成相關蛋白表達的影響。TYR是黑素合成的限速酶，據文獻報道其活性和表達直接影響黑素合成[9-10]。MITF是黑素合成的關鍵轉錄因子，并調控黑素相關蛋白TYR、TRP-1、TRP-2的表達，最終影響黑素合成[11]。結果顯示，紫鉚素劑量依賴性的促進人皮膚組織的TYR活性與黑素含量，見圖3，上調黑素相關蛋白TYR、TRP-1、TRP-2及MITF的表達，見圖4。

AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）是調節(jié)生物能量恒定性的重要傳感分子，能激活上游激酶LKB1、CaMKKβ和Takl等。AMPK的活性受AMP/ATP比值的調節(jié)，可調控能量代謝的分解與合成通路，調節(jié)脂肪細胞的代謝和血管功能，促進葡萄糖轉運和脂肪酸氧化等[12]。最近的研究發(fā)現，AMPK通路在調節(jié)黑素合成方面同樣發(fā)揮著重要作用。脂聯素和AICAR可以激活AMPK通路，進而下調正常人和小鼠黑素細胞中的MITF，酪氨酸酶，TRP-1和DCT表達并降低黑素含量[4]。二甲雙胍通過激活AMPK通路減少cAMP含量和cAMP反應元件結合蛋白（CREB）磷酸化導致小鼠黑素細胞瘤B16-F10細胞和正常人黑素細胞（NHM）中的黑素含量降低，這種抑制作用與黑素生成、MITF、酪氨酸酶、多巴色素互變異構酶和TRP1等基因的表達降低相關[13]。但是紫鉚素是否能夠通過影響AMPK活性調節(jié)黑素合成尚未有所報道。

與之前的研究結果相一致，α-MSH和紫鉚素能夠抑制PIG1細胞中AMPK活性，用AMPK特異性激動劑AICAR后，α-MSH和紫鉚素促進PIG1細胞黑素合成的作用消失。結果表明，紫鉚素促進PIG1細胞黑素合成的機制是通過抑制AMPK信號通路。

本研究探討驅蟲斑鳩菊中紫鉚素促進黑素合成的分子機制。紫鉚素通過抑制AMPK活性促進表皮黑素細胞的增殖及上調MITF及其調控的黑素合成相關蛋白的表達，從而促進人PIG1細胞的黑素合成。然而，目前紫鉚素及其衍生物對色素代謝及色素性皮膚病治療的具體機制尚未完全闡明，仍需進一步的探究。