楊若晨，段春輝，李閏婷，郭云霞，張英杰，劉月琴

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，河北 保定 071000)

催乳素(PRL)是一種由垂體前葉合成并分泌的多肽類激素[1-2]，PRL通過與其受體結(jié)合是發(fā)揮PRL生理功能過程中細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的第一步[3]。PRLR為僅含有1個(gè)跨膜區(qū)域的跨膜蛋白，由膜外域、跨膜域和胞內(nèi)域三部分組成，結(jié)構(gòu)具有多樣性。近年來，越來越多的研究表明，PRLR基因與繁殖息息相關(guān)。已知在反芻類動物中，綿羊、牛和山羊存在長型催乳素受體(L-PRLR)與短型催乳素受體(S-PRLR)2種剪接的轉(zhuǎn)錄本異形體[4-6]。SHI等[7]研究發(fā)現(xiàn)，L-PRLR在所有檢測的奶山羊組織中普遍表達(dá)，在肌肉中mRNA的豐度最高，其次是肝臟、皮下脂肪和乳腺，脾臟中豐度最低。李曉雨等[8]研究發(fā)現(xiàn)，PRLR在不同生理時(shí)期綿羊組織發(fā)揮的作用不同。但是目前PRLR的2種剪接體在動物生命活動中的功能還不明確，且在不同生理階段的表達(dá)規(guī)律也未見報(bào)道。

本試驗(yàn)通過研究小尾寒羊哺乳前期、中期、后期及斷奶后L-PRLR與S-PRLR的mRNA在綿羊乳腺中的表達(dá)變化，旨在為明確PRLR不同剪接體對乳腺功能的調(diào)節(jié)作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)和時(shí)間試驗(yàn)于2019年8月1日至2019年10月1日在河北省衡水市志豪畜科技有限責(zé)任公司進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)選取年齡一致、體質(zhì)量相近、同一天產(chǎn)雙羔的小尾寒羊母羊20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ組母羊分別在哺乳前期(產(chǎn)后7 d)、哺乳中期(產(chǎn)后29 d)、哺乳后期(產(chǎn)后50 d)、斷奶后5 d屠宰取乳腺組織。

1.3 試驗(yàn)羊的飼養(yǎng)管理20只試驗(yàn)羊于同一圈中飼養(yǎng)，試驗(yàn)期間的飼養(yǎng)管理按照衡水市志豪畜牧科技有限公司的飼養(yǎng)方案統(tǒng)一進(jìn)行。

1.4 樣品采集試驗(yàn)羊屠宰前1 d禁食，采用頸靜脈放血方式進(jìn)行屠宰，4次屠宰均在上午8：00進(jìn)行。屠宰去皮后，分離乳腺組織，剪碎至0.2 cm3的組織小塊立即投入液氮中，樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，-80℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RNA提取和cDNA合成按北京全式金TransZolTM試劑盒說明書提取乳腺組織中的總RNA，并去基因組DNA，42℃反應(yīng)2 min。反應(yīng)體系(10.0 μL)：5×gDNAEraser Buffer 2.0 μL，gDNA 1.0 μL，Total RNA 1.0 μL，RNA Free dH2O 6.0 μL。反轉(zhuǎn)錄cDNA反應(yīng)程序：42℃孵育15 min，85℃加熱5 s，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 RNA電泳檢測采用1×TAE電泳緩沖液配制1%瓊脂糖凝膠，調(diào)節(jié)電壓為100 V，使RNA由負(fù)極向正極電泳25 min。

1.7 ORT-qPCR應(yīng)用Oligo6.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參基因及L-PRLR、S-PRLA引物，引物序列見表1。RT-qPCR的反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。

表1 引物序列及產(chǎn)物片段長度

1.8 數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct計(jì)算乳腺組織中L-PRLR與S-PRLR的相對表達(dá)量。利用Graphpad 6.0軟件中的Ordinary One-way ANOVA和t檢驗(yàn)程序?qū)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。顯著性水平為P<0.05差異顯著，0.05

2 結(jié)果

2.1 小尾寒羊母羊乳腺組織中總RNA提取總RNA電泳結(jié)果顯示，18S和28S處條帶清晰可見，5S處條帶較弱(圖1)，表明RNA的完整性較好，降解不明顯。所有樣品均用分光光度計(jì)測量，D260/D280值均為1.80～2.00，表明樣品純度較好，無蛋白質(zhì)與DNA污染，樣品符合試驗(yàn)要求。

圖1 乳腺組織RNA電泳圖 M.Marker;1～3.產(chǎn)物

2.2 不同生理時(shí)期小尾寒羊乳腺組織中PRLR的剪接體mRNA表達(dá)分析不同生理時(shí)期小尾寒羊乳腺組織中PRLR的剪接體mRNA表達(dá)結(jié)果見圖2～4。由圖2可知，由哺乳前期至哺乳后期，L-PRLR 的相對表達(dá)量呈下降趨勢，而哺乳后期至斷奶后，L-PRLR的相對表達(dá)量呈上升趨勢。其中，L-PRLR的相對表達(dá)量在哺乳前期顯著高于哺乳后期(P<0.05)，其他時(shí)期L-PRLR的相對表達(dá)量均差異不顯著(P>0.10)。

由圖3可知，由哺乳前期至哺乳后期，S-PRLR的相對表達(dá)量呈下降趨勢，而哺乳后期至斷奶后，S-PRLR 的相對表達(dá)量呈上升趨勢。其中，S-PRLR的相對表達(dá)量在哺乳前期較哺乳后期有顯著增高趨勢(0.050.10)。

由圖4可知，小尾寒羊在哺乳前期、中期、后期及斷奶后的乳腺組織中S-PRLR的相對表達(dá)量均高于L-PRLR，且斷奶后L-PRLR在乳腺組織中的相對表達(dá)量顯著低于S-PRLR(P<0.05)，其他3個(gè)時(shí)期兩者的差異不顯著(P>0.10)。

圖2 小尾寒羊母羊乳腺組織中L-PRLR在4個(gè)時(shí)期的相對表達(dá)量 注：相同字母表示差異不顯著(P>0.10);不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)

圖3 小尾寒羊母羊乳腺組織中S-PRLR在4個(gè)時(shí)期的相對表達(dá)量 注：相同字母表示差異不顯著(P>0.10)；不同小寫字母表示差異有顯著趨勢(0.05

圖4 小尾寒羊母羊在4個(gè)時(shí)期L-PRLR與S-PRLR的相對表達(dá)量比較 注：*表示同一時(shí)期差異顯著(P<0.05)；未標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.10)

3 討論

3.1 PRLR不同剪接體的功能分析研究表明，2種亞型的PRLR共同表達(dá)對嚙齒類動物卵巢卵泡的正常生理發(fā)育具有重要意義[9]。大鼠中PRLR的mRNA在黃體期均表達(dá)，且L-PRLR的表達(dá)量大于S-PRLR[10-11]。THOMPSON等[12]對小鼠L-PRLR與S-PRLR在卵巢中的表達(dá)進(jìn)行分析，表明L-PRLR可能參與卵泡發(fā)育，而S-PRLR可能參與黃體的形成和維持。由此可知，L-PRLR與S-PRLR這2種剪接體在小鼠卵巢中的作用不同。ZI等[13]研究表明，在雜合子PRLR敲除雌性小鼠時(shí)，S-PRLR的過表達(dá)拯救了乳腺發(fā)育和功能。BERLANGA等[14]發(fā)現(xiàn)L-PRLR能激活β-酪蛋白基因啟動子，而S-PRLR沒有這種能力，同時(shí)2種剪接體的PRLR共同表達(dá)會阻礙PRL信號向乳蛋白基因啟動子的傳導(dǎo)，說明L-PRLR與S-PRLR在嚙齒類動物乳腺中的功能不同，且S-PRLR能抑制催乳信號的傳導(dǎo)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，泌乳量很低的泌乳前期、泌乳結(jié)束的斷奶后5 d的S-PRLR表達(dá)量均很高，間接驗(yàn)證了BERLANGA等[14]的研究結(jié)論。在哺乳動物中，對綿羊進(jìn)行免疫組織化學(xué)和逆轉(zhuǎn)錄PCR分析卵巢在整個(gè)發(fā)情周期內(nèi)S-PRLR和L-PRLR的定位和表達(dá)均存在差異，L-PRLR尤其局限于原始卵泡周圍的基質(zhì)細(xì)胞和原發(fā)性卵泡，而PRLR亞型均存在于竇前卵泡和黃體細(xì)胞的顆粒細(xì)胞中。在羊發(fā)情周期中發(fā)現(xiàn)S-PRLR的mRNA穩(wěn)定表達(dá)，但L-PRLR的mRNA表達(dá)量在發(fā)情期增加而在黃體中期和在卵泡期開始時(shí)下降[3]，而PRL不同剪接體在哺乳動物乳腺組織中的表達(dá)規(guī)律及生理功能有待進(jìn)一步研究。

3.2 泌乳生理階段對乳腺組織PRLR表達(dá)的影響B(tài)UCK等[15]報(bào)道，小鼠乳腺組織PRLR基因的表達(dá)水平在空懷期、妊娠期以及泌乳期無顯著性變化，但在泌乳前期至泌乳中期PRLR的表達(dá)量呈下降趨勢。CASSY等[16]研究了綿羊妊娠期和泌乳期PRLR基因在乳腺的發(fā)育和表達(dá)，結(jié)果表明PRLR mRNA的水平在妊娠期的第2個(gè)階段上升，在妊娠期的最后階段下降，泌乳期比妊娠期的水平高且保持相對穩(wěn)定。此外，在泌乳期及干奶期的奶山羊的乳腺組織中均檢測到PRLR的表達(dá)，且不同時(shí)期有差異，相對于泌乳前期，泌乳中期PRLR的表達(dá)量呈下降趨勢，在泌乳后期下降為最低點(diǎn)后至干奶期逐漸上升[8,17]。在本試驗(yàn)中，L-PRLR與S-PRLR在乳腺中的相對表達(dá)量均在哺乳前期達(dá)到最高，此后開始下降，在哺乳后期時(shí)表達(dá)量最低，斷奶后又呈上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，動物分娩前后，乳腺PRLR可增加數(shù)十倍，且PRLR在泌乳發(fā)動的2個(gè)階段(第1階段：妊娠后期開始少量分泌乳汁;第2階段：伴隨分娩分泌大量乳汁的起始階段)均增多，PRL可與乳腺分泌細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，促進(jìn)乳蛋白和酶的mRNA的合成，哺乳阻抑下丘腦的PRL釋放抑制激素的分泌，解除對腺垂體的抑制，催乳素的釋放增多，從而PRLR的相對表達(dá)量增多[18]，結(jié)果與本試驗(yàn)一致。本試驗(yàn)中L-PRLR與S-PRLR的相對表達(dá)量均在哺乳前期時(shí)達(dá)到最高，而泌乳高峰期過后，隨著泌乳量的降低，動物機(jī)體對PRL的需求量也逐漸降低，故哺乳前期至哺乳后期L-PRLR與S-PRLR的相對表達(dá)量均呈下降趨勢。李真等[17]的研究結(jié)果也與本試驗(yàn)一致，PRLR在干奶期表達(dá)量高于泌乳后期?？赡苁且?yàn)槊谌槠诮Y(jié)束后，乳腺進(jìn)入退化期，此時(shí)脂肪墊重新生成，脂肪細(xì)胞內(nèi)的PRLR mRNA含量較高[19]。因此，斷奶后L-PRLR與S-PRLR的表達(dá)量上升可能與乳腺重構(gòu)有關(guān)。

本試驗(yàn)在整個(gè)哺乳期及斷奶后5 d小尾寒羊乳腺組織中S-PRLR的相對表達(dá)量均高于L-PRLR，說明2種剪接體在乳腺中的生理作用存在差異。LESUEUR等[20]已經(jīng)證實(shí)了L-PRLR的作用是誘發(fā)PRL靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)PRL誘導(dǎo)信號的傳導(dǎo)，并且對PRL轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)有一定的功能；而S-PRLR 的作用仍不清楚。但是，最近的研究發(fā)現(xiàn)，綿羊PRLR cDNA的全長編碼序列S-PRLR與L-PRLR 分別對應(yīng)272和557個(gè)氨基酸，與反芻動物長型PRLR轉(zhuǎn)錄本相比，短型異形體轉(zhuǎn)錄本是由第9外顯子剪接到第9內(nèi)含子最后的39 bp而形成，此處插入的39 bp的3′末端含有2個(gè)連續(xù)的終止密碼子TAA和TAG，所以其編碼了反芻動物S-PRLR 的最后11個(gè)氨基酸[21]。基因組分析表明，這個(gè)片段的存在或缺失是造成同轉(zhuǎn)錄物交替剪接的原因，并非是存在不同的基因。而S-PRLR和L-PRLR編碼序列的唯一區(qū)別是在細(xì)胞質(zhì)域的起始處是否存在1個(gè)39 bp的插入，在其3′端有2個(gè)相鄰的插框終止密碼子[7]，因此，其編碼序列的不同可能導(dǎo)致了兩者功能的不同。小尾寒羊乳腺組織中PRLR的2種剪接體的具體功能及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。