楊瓊敏 程鋮 楊果 楊元勇（通訊作者）

（1 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院 貴州 貴陽 550025）

（2 安順市婦幼保健院 貴州 安順 561000）

細(xì)菌生物膜（Bacterial biofilms，BF）是由細(xì)菌分泌的核酸、蛋白質(zhì)以及多聚糖等組成的胞外聚合物[1]。研究表明，生物膜為成熟細(xì)菌提供保護[2]，是細(xì)菌耐藥的最主要原因，由于生物膜的存在使得細(xì)菌耐藥性增加10 ～1000 倍。細(xì)菌耐藥性是目前全球面對的嚴(yán)峻問題，基于此，通過抑制細(xì)菌生物膜從而降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生是一種全新的抗菌策略[3]。此外，由于生物膜對游離細(xì)菌的保護作用，導(dǎo)致細(xì)菌感染難以治愈并且有反復(fù)感染的可能[4]。

在生物膜形成過程中，細(xì)菌群體感應(yīng)（Quorum-Sensing，QS）系統(tǒng)起著至關(guān)重要的作用[5]。群體感應(yīng)現(xiàn)象是細(xì)菌之間信息傳遞的一種方式，即細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生、釋放特定的化學(xué)物質(zhì)進入環(huán)境中，當(dāng)濃度達到一定閾值后，即可啟動相應(yīng)基因的表達對群體行為進行調(diào)控的一種現(xiàn)象[6]。這種化學(xué)物質(zhì)被稱為細(xì)菌的自誘導(dǎo)物(Autoinducer，AI)。QS 不僅能夠調(diào)控生物膜的形成，而且能夠調(diào)控細(xì)菌的多種生物學(xué)功能如毒力產(chǎn)生、生物熒光、致病基因的表達等[7,8]。

由此可見，群體感應(yīng)系統(tǒng)在生物膜形成中起著至關(guān)重要的作用。近期研究表明，通過外加小分子化合物或者酶以干預(yù)或猝滅信號分子，從而干擾群體感應(yīng)系統(tǒng)可以有效降低生物膜的形成。具體方法是通過化學(xué)合成自誘導(dǎo)劑結(jié)構(gòu)特性相類似物，這些化合物能競爭性的與自誘導(dǎo)劑受體蛋白相結(jié)合，從而抑制生物膜的形成[9,10]。

本文旨在合成根據(jù)革蘭氏陰性菌自誘導(dǎo)物結(jié)構(gòu)特性從而合成出其結(jié)構(gòu)類似物，用于測定對于A.bauman Ⅱ、E.coli和P.Aeruginosa 三類菌株BF 的抑制情況，為以后的抗菌藥物研究提供理論參考。

1.資料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

紫外—可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；酵母提取液（生工生物工程（上海）股份有限公司）；胰化蛋白胨（生工生物工程（上海）股份有限公司）；結(jié)晶紫（阿達瑪斯試劑有限公司）；36%乙酸溶液（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；95%乙醇溶液（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)化合物的合成 在250mL 圓底燒瓶中依次加入1.08g2-氨基咪唑原料（5m mol），1.07mL 氯甲酸芐酯原料（5mmol），再加入Et3N（5mmol）作為堿，DCM5.00mL 作為溶劑，室溫反應(yīng)8h，經(jīng)薄層色譜法檢測（石油醚∶乙酸乙酯=1 ∶1），確認(rèn)反應(yīng)結(jié)束后，用乙酸乙酯萃取三次，有機相用Na2SO4 干燥，靜置，抽慮，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，得白色粉末，后用乙酸乙酯和水進行重結(jié)晶，過濾得純品。共計合成出9 個化合物，結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1

1.2.2 活性測試 使用96 孔聚苯乙烯板構(gòu)建生物膜，測定其形成能力。在96 孔板中，每孔加入190μL 菌液和10μL 上述合成的化合物溶液，每個樣品平行測定8 孔，通過調(diào)節(jié)OD600值使菌液濃度達到106C FU/mL，并將化合物終濃度調(diào)節(jié)至100mol/L。其中鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ S1 △abaI）僅為正常鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）缺失一段abaI 基因，因此將鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ S1 △abaI）僅僅設(shè)置為正常鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）中的陰性對照。在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h。

培養(yǎng)24h 后，將96 孔板中菌液吸出，用雙蒸水反復(fù)沖洗兩次（200μL/孔），以去除浮游菌；將雙蒸水吸出，加入95%乙醇溶液（200μL/孔），固定生物膜30min；將固定液去除，自然風(fēng)干后，加入1%結(jié)晶紫染液（200μL/孔），在室溫下染色10min；丟棄染液，用流水把多余的染液沖洗干凈；并室溫涼干或在37 ℃烘箱中烘干；完全干燥后，加入36%乙酸溶液（200 μL/孔），在電熱恒溫培養(yǎng)箱中以37 ℃作用30 min 以溶解結(jié)晶紫；在570nm 單波長條件下，用酶標(biāo)儀測定培養(yǎng)孔中溶液的OD 值。

2.結(jié)果

每個化合物和每種菌株均為8 個復(fù)孔，將最終讀數(shù)去掉最高值和最低值，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以未加目標(biāo)化合物，以10μ L D M S O 溶液代替的菌液作為空白對照。其中，將缺失一段abaI 基因的鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ S1 △a b a I）不加目標(biāo)化合物，設(shè)置為正常鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）中的空白對照。9 種化合物對鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）、銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa ATCC 27853）、大腸桿菌（E.coli DH5α）生物膜抑制活性測試結(jié)果見圖2-4。

圖2 鮑曼不動桿菌生物膜OD 值Fig.2 OD value of Acinetobacter baumann Ⅱ biofilm

圖3 銅綠假單胞菌生物膜OD 值Fig.3 OD value of Pseudomonas aeruginosa biofilm

圖4 大腸桿菌生物膜OD 值Fig.4 OD value of E.coli biofilm

3.討論

在鮑曼不動桿菌（A.baumann Ⅱ）生物膜抑制活性測試中，這一種細(xì)菌BF 九個目標(biāo)化合物均對其生物膜有抑制作用，其中化合物Ⅴ（N-（1H-咪唑-2-基）十二酰胺）具有較強抑制活性，與其他化合物相比，直連烷烴的效果較好，且12 個碳原子效果最佳。后期研究將以此作為指導(dǎo)進行下一步結(jié)構(gòu)改造。

銅綠假單胞菌（Ps.aeruginosa ATCC 27853）生物膜形成能力測試中，九個目標(biāo)化合物中僅有一個化合物對其生物膜有抑制作用，且活性偏低，基本可認(rèn)為無抑制作用。需要合成更多具有與AHLs 相似具有親水親脂基團的化合物，進行BF 抑制活性測試。

大腸桿菌（E.coli DH5α）是生活中極為常見的細(xì)菌，在本次生物膜抑制活性測試中，九個目標(biāo)化合物均對其有較好的抑制作用，且抑制程度相近，其具體應(yīng)用還有待進一步的研究。

本次研究提供了數(shù)個具有活性的生物膜抑制劑，主要意義在于希望為后續(xù)的抗菌藥物研發(fā)提供理論參考，以及為新型抗菌藥物研發(fā)提供候選化合物。