俞旭東 錢(qián)葉本（通訊作者）

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 安徽 合肥 230022）

肝細(xì)胞癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率排名第六的癌癥，并且是導(dǎo)致患者死亡的第四大最常見(jiàn)原因，其特點(diǎn)是高度增殖、異質(zhì)性和侵襲性[1]。肝癌治療方法多樣，主要包括根治性切除術(shù)、肝移植術(shù)、射頻消融術(shù)及放療和化療等方法。但其臨床療效有限，復(fù)發(fā)率高，肝癌患者的生存率較低[2,3]。目前肝癌缺乏特異性預(yù)后標(biāo)志物。TCP1 環(huán)復(fù)合物是一種ATP 依賴性分子伴侶蛋白，其由八個(gè)不同的亞基（命名為CCT1 至CCT8）組成。TCP1 環(huán)復(fù)合物可以折疊肌動(dòng)蛋白和微管蛋白，參與癌細(xì)胞的增殖，遷移[4-5]。作為T(mén)CP1 環(huán)復(fù)合物的亞基，CCT4 在惡性腫瘤中的作用鮮有報(bào)道。本文基于癌癥基因圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共數(shù)據(jù)庫(kù)肝癌組織標(biāo)本數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)分析CCT4 在肝癌中的表達(dá)并使用PCR 和免疫組化驗(yàn)證；同時(shí)還分析了其異常表達(dá)在肝癌患者中的臨床意義和其潛在機(jī)制。本文旨在闡明CCT4 在評(píng)估肝癌患者預(yù)后中的價(jià)值。

1.資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和處理

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù) (https：//tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) 下載374 個(gè)HCC 組織和50 個(gè)正常肝組織樣品的mRNA seqV2 表達(dá)譜數(shù)據(jù)和377 例HCC 患者的臨床病理數(shù)據(jù)。下載的臨床數(shù)據(jù)包括的指標(biāo)為生存期、生存狀態(tài)、年齡、性別、分級(jí)和TNM 分期。

1.1.1 差 異 表 達(dá) 分 析 使 用limma 包(http：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)分析CCT4 在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中所包含的374 個(gè)HCC 組織和50 個(gè)正常肝組織樣品中的表達(dá)差異。

1.1.2 生存曲線 剔除TGCA 數(shù)據(jù)里中肝癌樣本中生存數(shù)據(jù)不全的患者，剩余370 例患者。以CCT4 在這些組織中表達(dá)的中位值為截?cái)嘀担瑢⒒颊叻譃镃CT4 高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用survival 包(https：//cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)分析兩組患者的總生存率。

1.1.3單因素和多因素Cox分析 剔除任意指標(biāo)不全的患者，剩余235 例患者。使用survival 包(https：//cran.r-project.org/web/packages/survival/index.html)行單因素和多因素Cox分析。

1.1.4 臨床相關(guān)性分析 剔除指標(biāo)不全的患者，剩余370 例年齡信息齊全的患者，371 例性別信息齊全的患者，367 例分級(jí)信息齊全的患者，353 例TNM 分期信息齊全的患者，分析各指標(biāo)與CCT4 的表達(dá)關(guān)系。

1.1.5 GSEA富集 使用GSEA 軟件(software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)和全基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行GSEA 富集分析。根據(jù)CCT4 表達(dá)中位值將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，比較兩組患者的其他基因表達(dá)差異，根據(jù)KEGG 富集要求對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行通路富集。Nom p-val ＜0.05 和FDR q-val ≤0.25 視作有意義。

1.1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 檢索數(shù)據(jù)庫(kù)String (https：//string-db.org/)和，Genemania (http：//genemania.org/)以篩選人體內(nèi)和CCT4的互作蛋白。String篩選的基因截?cái)嘀禐?.4，大于0.4 表示相關(guān)性較強(qiáng)。使用cytoscape 軟件繪圖。

1.2 臨床樣本

我們收集了2015 年-2019 年安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科收治的肝癌患者中的60 例肝細(xì)胞癌患者，所有病例經(jīng)手術(shù)后病理資料證實(shí)為肝癌患者，對(duì)于臨床資料的完善與否不作特殊性要求。另收取60 例取自遠(yuǎn)離癌組織中心5cm 以上的癌旁正常組織作為對(duì)照，所有患者術(shù)前均均未行放、化療。選取2019 收集的肝癌組織中的15 例，經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，4μm 厚切片保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RNA 提取和qRT-PCR

根據(jù)Biotech RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取60 對(duì)癌與癌旁組織的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的脫氧核糖核酸（cDNA）。試用Nanodrop 2000 分光光度計(jì)（Thermo Scientific，美國(guó)）測(cè)量RNA 的濃度及純度。使用SYBER Green I Master Mix 方案行qRT-PCR，反應(yīng)體系為10μ L,反應(yīng)條件為：95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 30s，72℃ 20s，40 個(gè)循環(huán)；95℃，5s，65℃，1min。CCT4 正向引物：5′-ATGCCCGAGAATGTGGCAC-3′；反向引物：5′-GCTTGTCGCGGTCCTGATAG-3′。使用β-actin 為內(nèi)參，β-actin 正向引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3′；β-反向引物：5′-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′。

1.4 免疫組化

將組織切片脫蠟，水合，通過(guò)檸檬酸鹽抗原修復(fù)溶液（用PBS 稀釋）在微波條件下修復(fù)，CCT4 單克隆抗體（中國(guó) Proteintech 公司，貨號(hào)：21524-1-AP）以1 ∶100 稀釋，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的二抗(購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Jakson 公司)以1 ∶200 的比例稀釋。顯微鏡下拍照，觀察肝臟組織中的CCT4 蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用Wilcox 秩和檢驗(yàn)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中CCT4 在不配對(duì)肝癌和正常組織中的差異表達(dá)。使用t檢驗(yàn)分析qRT-PCR 檢測(cè)的CCT4在配對(duì)癌和癌旁組織中表達(dá)。使用χ2檢驗(yàn)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中CCT4 表達(dá)水平與肝癌患者的臨床病理特征關(guān)系；Log-Rank 法檢驗(yàn)行單因素和多因素Cox分析。以P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 CCT4 在肝癌中的表達(dá)水平

我們首先比較了CCT4 mRNA 在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)里374 個(gè)肝癌和50 個(gè)正常組織中的表達(dá)(圖1A)，同時(shí)使用qRT-PCR 檢測(cè)CCT4 mRNA 在60 例配對(duì)癌和癌旁組織中表達(dá)以驗(yàn)證TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果(圖1B)。結(jié)果表明,CCT4mRNA 在肝癌組織中的表達(dá)顯著高于其在癌旁的表達(dá)(圖1A/B)(P=1.085e-23,P＜0.001)。進(jìn)一步，我們使用免疫組化檢測(cè)CCT4 蛋白在15 例配對(duì)癌和癌旁組織中表達(dá)(圖1C)。結(jié)果提示在癌組織中CCT4 蛋白表達(dá)較高?？傊珻CT4 mRNA 和蛋白在癌組織中高表達(dá)。

圖1 注：A.在TCGA 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中CCT4 在癌旁與肝癌組織中的表達(dá)差異；B.在60 對(duì)標(biāo)本中CCT4 在癌旁和肝癌組織的表達(dá)差異；C.CCT4 在肝組織的免疫組織化學(xué)染色（左邊配對(duì)癌旁組織，右邊配對(duì)肝癌組織）

2.2 CCT4 在肝癌中的預(yù)后價(jià)值

為了探討CCT4 在肝癌中的預(yù)后價(jià)值，我們使用Kaplan-Meier 法繪制了生存曲線，同時(shí)使用log-Rank 法行單因素和多因素cox 回歸分析。如圖2 所示，CCT4 高表達(dá)組患者的1 年-，3 年-和5 年總生存率分別約為75.1%，52.5%和41.7%；CCT4 低表達(dá)組患者的1 年-，3 年-和5 年總生存率分別約為89.7%，70.2%和53.6%。CCT4 高表達(dá)組患者的總生存率更低 (P=0.005)。見(jiàn)表1 所示，單因素Cox 分析結(jié)果提示TNM 分期 (HR[95%CI]=1.86[1.46 ～2.39]) (P＜0.01)、T 分 期 (HR[95%CI]=1.8[1.43 ～2.27]P＜0.01)、M 分 期(HR[95%CI]=3.85[1.21 ～12.28]P＜0.01) 及CCT4 表 達(dá)(HR[95%CI]=1.02[1.01 ～1.03]P＜0.01)與患者預(yù)后相關(guān)。多因素Cox 分析結(jié)果提示，CCT4 mRNA 表達(dá)（HR[95%CI]=1.02[1.01～1.03]P＜0.01）是肝癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？傊珻CT4是肝癌獨(dú)立不良預(yù)后因子。

圖2 在TCGA 數(shù)據(jù)中CCT4 的表達(dá)與肝癌患者的生存分析

表1 TCGA 中CCT4 的單因素和多因素Cox 回歸分析

2.3 CCT4 表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

如圖3 所示，CCT4 表達(dá)與患者的性別無(wú)關(guān)。但是與患者的年齡(P＜0.022)、病理分級(jí)(P＜0.001)及TNM 分期呈正相關(guān) (P＜0.001)。

圖3 A.以中位值為界限將肝癌患者中不同的年齡分為高低兩組，CCT4 的表達(dá)與年齡的相關(guān)性；B.根據(jù)肝癌患者的性別進(jìn)行分組，CCT4 的表達(dá)與性別的相關(guān)性；C.CCT4 的表達(dá)與肝癌患者中不同病理分級(jí)的關(guān)系；D.CCT4 的表達(dá)與肝癌患者中不同的病理分期的關(guān)系

2.4 GSEA 富集分析結(jié)果

我們使用GSEA 軟件對(duì)HCC 中CCT4 進(jìn)行GSEA 富集分析,以探索CCT4 調(diào)控的基因集。我們分析了CCT4 對(duì)178 個(gè)富集通路的影響。如圖4 所示分析結(jié)果提示與細(xì)胞周期及WNT 信號(hào)通路,MAPK信號(hào)通路和VEGF通路途徑有關(guān)的基因組在CCT4的高表型中上調(diào)。

圖4 示：使用GSEA 軟件對(duì)CCT4 在肝癌中進(jìn)行GSEA 富集分析,所得到的4個(gè)與癌癥關(guān)系密切相關(guān)由CCT4 高表型所富集到的通路.

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

我們檢索了String 和Genemania 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)以分析CCT4 在人體的互作蛋白。結(jié)果如圖5 所示這些蛋白主要包括PFDN 復(fù)合物中多個(gè)亞基（PFDN1,PFDN2,PFDN4,PFDN5,PFDN6）及CDC20 蛋白,SPHK1 蛋白等。

圖5 示：通過(guò)使用String,Genemania 兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)CCT4 的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

3.討論

CCT 復(fù)合物屬于分子伴侶蛋白，其可通過(guò)折疊肌動(dòng)蛋白及微管蛋白而參與細(xì)胞的分裂和遷移[12]。此外，在腫瘤中，CCT4 還可通過(guò)折疊癌基因或抑癌基因而調(diào)控腫瘤進(jìn)展。這些基因包括VHL、P53、STAT3、cyclin E和CDC20等[6-10]。作為CCT家族的一員，CCT4 的丟失可抑制食道鱗狀細(xì)胞癌的增殖、侵襲和遷移[11]。但是目前CCT4 在HCC 的作用仍不清楚。

本研究比較TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中CCT4 mRNA 在肝癌中的表達(dá)并通過(guò)qRT-PCR和免疫組化在肝癌患者標(biāo)本中驗(yàn)證TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)CCT4 在肝癌組織中高表達(dá)。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌患者行生存分析、單因素和多因素回歸分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的CCT4 的患者預(yù)后較差，且CCT4 是肝癌的獨(dú)立預(yù)后因子。這提示CCT4 在肝癌中表達(dá)上調(diào)，且充當(dāng)預(yù)后標(biāo)志物。

此外我們通過(guò)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及GSEA 富集分析初步討論了CCT4 在肝癌中的潛在機(jī)制。GSEA 的結(jié)果表明細(xì)胞周期、VEGF 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路和Wnt 信號(hào)通路的相關(guān)基因在CCT4 高表型中表達(dá)上調(diào)。MAPK 信號(hào)通路通過(guò)多種級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)揮作用，MAPK/ERK 信號(hào)通路的異常激活在肝癌中發(fā)揮重要作用[12]。Wnt信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、存活、自我更新和分化等[13-14]。在肝癌中Wnt/β-catenin 信號(hào)通路的活化與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)[15]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，CCT4 與PFDN 蛋白中的數(shù)個(gè)亞基互作。PFDN 亞基可以在HepG2 肝癌細(xì)胞中以高親和力與癌基因HDAC1互作而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[16]。CDC20 是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵分子[17]。chu 等研究表明CDC20 可能通過(guò)Wnt /β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[18]。綜上CCT4 可通過(guò)與PFND 的亞基及CDC20 互作而參與調(diào)控肝癌進(jìn)展。

但是，我們的研究仍然存在一些局限性。（1）組化樣本不足。（2）沒(méi)做細(xì)胞功能學(xué)和裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。（3）未驗(yàn)證GSEA 富集和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)所得出的結(jié)果。這些不足正是我們下一步的研究重點(diǎn)。盡管存在局限性，我們的研究表明CCT4 是肝癌預(yù)后有價(jià)值的標(biāo)志物.