葉純子，董希文，吳炳懿

(哈爾濱市林業(yè)科學(xué)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028)

篤斯越橘(Vacciniumuliginosum)又稱篤斯、都柿、野生藍(lán)莓，為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)落葉灌木。篤斯越橘資源豐富，具有較高的野生觀賞價值[1]，我國黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、遼寧等地均有分布[2]，喜光，喜濕，耐低溫[3]，主要生長在針闊葉混交林或針葉林下沼澤草甸或疏林處[4]，海拔300～900 m的泥炭鮮沼澤草甸中也有分布。篤斯越橘果實營養(yǎng)豐富，果中含有豐富的維生素、糖類、氨基酸，微量元素等營養(yǎng)成分[5,6]。目前關(guān)于藍(lán)莓研究較多，在實驗室的組織培養(yǎng)[7]、無性扦插、苗木栽培的相關(guān)研究已經(jīng)積累了豐富的經(jīng)驗，且具有較大的參考價值。但國內(nèi)針對篤斯越橘在多激素組合及碳源應(yīng)用上的研究并不太多。該試驗從激素和碳源上探究這些因素對篤斯越橘繼代增殖的調(diào)節(jié)作用，從而找適宜的培養(yǎng)基用于開展篤斯越橘繼代試管苗的快速繁殖，以期獲得合理有效且節(jié)本的生產(chǎn)組合方案，為進(jìn)一步提高工廠化育苗生產(chǎn)效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究材料為野生藍(lán)莓組培苗，來源于哈爾濱市林業(yè)科學(xué)研究院組織培養(yǎng)室。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同激素對篤斯越橘繼代生長的影響 選取健壯的試管苗，在無菌操作臺上剪取生長狀況相同的苗芽莖段接種到繼代增殖培養(yǎng)基中。以改良WPM為基本培養(yǎng)基〔以Ca(NO3)2·4H2O、KNO3代替原WPM培養(yǎng)基中的K2SO4、CaCl2，F(xiàn)e鹽加倍〕，將試管苗莖段分別轉(zhuǎn)接于改良的WPM培養(yǎng)基，附加蔗糖25 g·L-1、瓊脂7 g·L-1，分別添加不同濃度的ZT(0.5、1.0、1.5)、KT(0、0.5、1.0)和IBA(0、0.3、0.5)組合，對ZT濃度、KT濃度、IBA濃度進(jìn)行3因子3水平的L9 (33)正交試驗。培養(yǎng)45 d后，觀察苗生長狀況，測定叢生芽增殖個數(shù)、高度，研究不同濃度的ZT、KT、IBA對篤斯越橘試管苗繼代增殖的影響，篩選最優(yōu)組合。每處理接種5個芽，接種10瓶，重復(fù)3次。

1.2.2 不同碳源對篤斯越橘繼代生長的影響 選取長勢相同、健壯的篤斯越橘試管苗接種到改良WPM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基碳源分別為不同濃度的蔗糖(20、30和40 g·L-1)和白糖(20、30和40 g·L-1)，培養(yǎng)45 d。每處理接種5個芽，接種10瓶，重復(fù)3次。觀察試管苗的生長情況，篩選出適宜的碳源及其濃度。

1.2.3 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)基高壓滅菌前的pH值均為5.3～5.5，在121 ℃下高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為25 ℃±2 ℃，光周期為14 h·d-1，光照度為2 000～2 500 lx。

1.2.4 統(tǒng)計方法 接種第45天觀察叢生芽生長狀況，計算芽平均個數(shù)、平均高度，統(tǒng)計增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=(萌出的莖段數(shù)/組培苗的株數(shù))×100%

數(shù)據(jù)用Excel、SPSS19.0等軟件進(jìn)行方差分析和Dancan多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1不同激素類型和濃度對篤斯越橘繼代生長的影響

表1 不同激素類型和濃度對篤斯越橘繼代生長的影響

由表1可知，不同處理之間的篤斯越橘叢生芽萌發(fā)數(shù)量、芽高、增殖系數(shù)及生長狀況等相差較大。從實際試驗結(jié)果來看，處理2即改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+ IBA 0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基的增殖效果好，其叢生芽個數(shù)6.5個，平均高度為5.92 cm，增殖倍數(shù)達(dá)到了18.4，誘導(dǎo)出的芽苗長勢好，生長旺盛，芽莖粗，葉片顏色較深，為濃綠色(圖1)。其次為處理6組，未添加激動素，增殖倍數(shù)為15.8，芽苗長勢好，芽莖粗，葉濃綠色。在試驗中發(fā)現(xiàn)，在不添加其他激素的情況下，當(dāng)ZT濃度降低到0.5 mg·L-1水平單獨(dú)作用于培養(yǎng)基時，此培養(yǎng)基中篤斯越橘試管苗增殖倍數(shù)顯著下降，僅為6.5(圖2)。究其原因，處理1組中分裂素水平較低，雖然芽生長速度較快，平均高度達(dá)6.51 cm，是所有處理組中最高的，但其分化的愈傷組織較小，叢生芽數(shù)量較少，僅為2.3，遠(yuǎn)低于其他組，導(dǎo)致整體增殖效率較低。

2.2培養(yǎng)基中不同碳源對篤斯越橘繼代生長的影響

糖分是植株生長的主要營養(yǎng)來源，是培養(yǎng)基中碳源來源的主要途徑。通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖、白糖兩種碳源進(jìn)行試驗，研究結(jié)果(表2)表明，在改良WPM+ZT 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+瓊脂7 g·L-1的培養(yǎng)基中，蔗糖、白糖分別作為碳源在相同濃度水平下，在篤斯越橘繼代增殖效率上，兩者差異不顯著；但濃度不同時影響較大，且差異性顯著。其中，采用蔗糖濃度為30 g·L-1的處理增殖效果較好，芽增殖系數(shù)最高，為19.6；其次是白糖濃度為30 g·L-1的處理，增殖系數(shù)為19.2。這兩個處理間對篤斯越橘不定芽繼代增殖培養(yǎng)的增殖系數(shù)影響差異不顯著，且在植株生長狀態(tài)上2組處理的植株生長正常，均有較多新芽長出，在苗長勢上兩者間無明顯差異。因此，從經(jīng)濟(jì)效益的角度出發(fā)，在篤斯越橘組培生產(chǎn)中為了降低生產(chǎn)成本，可以選用白糖替代蔗糖。

從表2還可以看出，不論是白糖還是蔗糖，在平均苗數(shù)、平均苗高及增殖系數(shù)上，處理20 g·L-1濃度、處理30 g·L-1濃度與處理40 g·L-1濃度間差異達(dá)到顯著水平。在生長狀況上，以處理30 g·L-1濃度最好，芽苗健壯，莖較粗，葉片呈濃綠色，優(yōu)于其他的濃度水平。

3 結(jié)論與討論

3.1 在植物組織培養(yǎng)中，除了基本培養(yǎng)基外，激素種類和濃度是影響繼代增殖的重要因素。此外，細(xì)胞生長素和細(xì)胞分裂素濃度配比也很重要，過高的生長素可能會抑制試管苗莖的伸長導(dǎo)致幼苗矮化。從實驗結(jié)果來看，在篤斯越橘試管苗繼代增殖階段，細(xì)胞分裂素ZT、KT及細(xì)胞生長素IBA對芽的誘導(dǎo)和增殖作用至關(guān)重要。分裂素ZT適用于不定芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)時間短，兩周左右就可以誘導(dǎo)出篤斯越橘不定芽；KT與IBA協(xié)同作用對叢生芽的生長有良好的促進(jìn)作用。通過本研究分析可知，在蔗糖 25 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1條件下，改良WPM附加ZT 0.5 mg·L-1、KT 0.5 mg·L-1、IBA 0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基能較好地誘導(dǎo)篤斯越橘叢生芽萌發(fā)增殖，45 d時增殖系數(shù)為18.4。

3.2 糖在組織培養(yǎng)中的效應(yīng)已越來越引起人們的重視，作為碳源，糖既可為植物細(xì)胞的呼吸代謝提供能量，還可維持培養(yǎng)環(huán)境的滲透勢。糖在培養(yǎng)基里的種類和用量對培養(yǎng)物生長速度和生長量有一定的影響。在比較不同碳源對篤斯越橘試管苗生長的影響中，試驗結(jié)果表明，使用改良WPM +ZT 0.5 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1培養(yǎng)基對篤斯越橘芽的增殖效果最好，用相同濃度的白糖替換蔗糖后，篤斯越橘試管苗增殖倍數(shù)略有降低，但差別不大；而且從生長情況來看，以白糖為碳源的叢生芽長勢與以蔗糖為碳源的叢生芽長勢相似，苗莖粗細(xì)、高度及葉片顏色均無明顯差別。因此，本研究認(rèn)為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)篤斯越橘組培苗時，在盡量保證苗質(zhì)量的前提下，為了降低生產(chǎn)成本，可以選擇白糖作為碳源。