陳炳竹 王潤英 趙懿琛 趙德剛

摘要：本研究通過NCBI的BLAST比對分析，最終從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選出28條朝倉花椒Dirigent（DIR）蛋白家族的編碼基因序列。利用 MEGA、MEME、DNAMAN 等軟件對該蛋白家族進行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示：從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組中獲得的28個DIR基因，經(jīng)過鑒定，在進化上分

為6個小組，每個小組的基因數(shù)量分別為7、5、1、0、5、10。該家族的蛋白等電點均小于7，均偏酸性，且多數(shù)屬于穩(wěn)定蛋白。多基因序列比對比發(fā)現(xiàn)，該家族蛋白均具有一個高保守性的DIR結(jié)構(gòu)域。空間結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測ZpDIR 蛋白多為多鏈線性折疊卷曲蛋白，且以線性無鏈非規(guī)則多鏈卷曲蛋白為主。

關(guān)鍵詞：朝倉花椒;DIR基因家族;生信分析

中圖分類號：Q811.4

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0457（2020）02-0021-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2020.02.003

Identification and analysis of DIR Gene Family in Zanthoxylum piperitum

DC.var.inerme Makino

CHEN Bingzhu1，WANG Runying1，ZHAO Yichen1*，ZHAO Degang1，2

（1.College of Life Sciences/College of Tea? Sciences， Guizhou University， Key Laboratory of Germplasm Innovation for

Conservation and Protection of Mountain Plant Resources， Guizhou Key Laboratory of Agricultural Biological Engineering， Guiyang， Guizhou 550025， China;2.Guizhou Academy of Agricultural Sciences/Guiyang Branch of National DUS Center，? Guiyang， Guizhou? 550006， China）

Abstract：

In this study， 28 coding gene sequences of the Zanthoxylum piperitum DC.var.

inerme Makino Dirigent （DIR） protein family from Z. piperitum DC.var.

inerme Makino transcriptome database were screened via GenBank National Center for Biotechnology Information （NCBI） Basic Local Alignment Search Tool （BLAST）. Bioinformatics analysis of the protein family was carried out using MEGA， MEME， DNAMAN and other softwares. This research through the NCBI BLAST ratio analysis， finally from the Zanthoxylum? piperitum DC.var.inerme Makino transcriptome database selected article 28 at the Zanthoxylum piperitum DC.var.inerme Makino Dirigent（DIR） protein family encoding gene sequences using the MEGA， MEME， DNAMAN software such as bioinformatics analysis， carried out on the protein familyThe results showed that the 28 DIR genes obtained from Z. piperitum DC.var.inerme Makino transcriptome were identified and belonged to 6 subfamilies in evolution， according to the results of identification from the Zanthoxylum piperitum DC.var.inerme Makino transcriptome of 28 DIR genes in evolutionary points belong to 6 family， The number of genes in each subfamily was 1， 20， 3， 1， 2， and 1， respectively.each family of the number of genes of 20， 3， 1， 2， 1 respectively. The isoelectric points of the proteins ofin this family arewere all less than 7， all of themwhich are acidic， and most of them belong to? the stable proteins polygene sequence ratio. The results of multiple gene sequence comparisons showed that the family proteins all had a highly conserved DIR domain. The analysis of spatial structure predicts that most ZpDIR proteins were multi-chain linear folded coiled proteins， and mainly linear non-chain irregular multi-chain coiled proteinsIt was found that the proteins of this family all have a highly conserved DIR domain spatial structure.

Keywords：Zanthoxylum piperitum;

DIR gene family; bioinformatics analysis

木脂素激酶是分布廣泛的一類植物次生細(xì)胞代謝活性物質(zhì)，具有一定抗菌抗病特性，參與很多植物機體抗病生長過程，Dirigent（DIR）蛋白參與木脂素的合成，是木脂素合成途徑的重要蛋白[12]。對小麥、楊樹、擬南芥和水稻等植物的

DIR基因家族進行鑒定發(fā)現(xiàn)，DIR蛋白相對比較保守，大多數(shù)DIR基因含有一個DIR結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是DIR蛋白的主要組成結(jié)構(gòu)域[3]。DIR蛋白不僅在植物次生代謝產(chǎn)物合成過程中發(fā)揮作用，還參與植物抗逆性，在植物抵御非生物脅迫、生物防御應(yīng)答中起重要作用。

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）作為我國常用的藥食兩用作物，具有較高的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值。除此之外，已有研究發(fā)現(xiàn)花椒還具有很好的抗菌能力，其對包括炭疽桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌在內(nèi)的革蘭氏陽性菌以及大腸桿菌、變形桿菌、霍亂弧菌等多種革蘭氏陰性菌有很好的抑制作用[4]。朝倉花椒（

Zanthoxylum piperitum DC.var.inerme Makino）也稱山椒，為蕓香科（Rutaceae）花椒屬

（Zanthoxylum L.）落葉灌木[5]，具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、精油含量高等特點。本實驗室前期針對朝倉花椒在抗菌方面的分子機制展開了相關(guān)研究，目前已成功克隆得到一個朝倉花椒幾丁質(zhì)酶類似基因ZaCHIT1-like[6]。本研究主要對朝倉花椒中具有抗菌活性的DIR蛋白家族進行鑒定和生物信息學(xué)分析，以期對朝倉花椒抗菌調(diào)控機制的研究提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中提取的31條朝倉花椒DIR蛋白家族的編碼基因序列作為本研究的實驗材料。

1.2朝倉花椒DIR基因家族的鑒定

本研究基于前期獲得的朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫注釋信息，從朝倉花椒轉(zhuǎn)錄組中初步篩選獲得31條DIR蛋白的編碼序列，并通過與NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 數(shù)據(jù)庫中BLAST比對和保守結(jié)構(gòu)域分析[7]，最終鑒定出28條朝倉花椒的DIR家族基因序列。

1.3朝倉花椒DIR蛋白基本性質(zhì)

采用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在線分析工具[8]預(yù)測分析朝倉花椒DIR蛋白家族的理化性質(zhì)。

1.4進化關(guān)系分析

利用朝倉花椒DIR家族序列在BLAST程序上比對出3個同源性較高的物種：蒺藜苜蓿（

Medicago truncatula）、擬南芥（

Arabidopsis thaliana L.）、甜橙（

Citrus sinensis）。并從基因序列下載網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#）中下載蒺藜苜蓿、擬南芥和甜橙已經(jīng)發(fā)表了的DIR蛋白氨基酸序列，利用MEME軟件構(gòu)建DIR基因系統(tǒng)進化樹。

1.5ZpDIR蛋白結(jié)構(gòu)分析

采用SOPMA在線工具完成蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測分析[9]，采用SWISS-MODEL在線分析軟件完成蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測[10]。

1.6ZpDIR多序列比對和保守基序分析

利用DNAMAN序列分析軟件對得到的28條序列進行多序列比對[11]，在線分析軟件MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）定位各條DIR蛋白序列的保守基序[12]。

2結(jié)果與分析

2.1ZpDIR基因家族的鑒定

通過朝倉花椒的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的注釋信息和NCBI數(shù)據(jù)庫的比對結(jié)果，對初步篩選得到的31個DIR候選基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，最終鑒定獲得28條朝倉花椒DIR家族基因，并將其命名為

ZpDIR1～ZpDIR28（表1）。利用ExPASy在線軟件，對該家族的28個蛋白分別進行理化性質(zhì)的分析，結(jié)果顯示，該家族基因在分子大小上具有顯著差距，其中基因編碼長度最短的為

ZpDIR27， 其長度為120 bp，基因編碼長度最長的基因為

ZpDIR28， 其編碼基因總長度為1209 bp，兩者差距近10倍。由此可知其對應(yīng)的蛋白大小相差較大，28個蛋白的相對分子量在28.39 kDa～101.39 kDa之間，其中蛋白分子量最小的為

ZpDIR11， 最大的為ZpDIR28

。對其蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測顯示，該家族蛋白雖然在大小上差異顯著，但均為偏酸性蛋白，等電點范圍在

5.03～5.42。

2.2ZpDIR 蛋白進化關(guān)系分析

為研究ZpDIR的進化關(guān)系，使用MEGA軟件構(gòu)建朝倉花椒與蒺藜苜蓿、擬南芥和甜橙的DIR家族系統(tǒng)進化樹，根據(jù)進化樹的分枝，可將朝倉花椒DIR家族（ZpDIR1-ZpDIR28）與蒺藜苜蓿DIR家族（MtDIR1～MtDIR45）、擬南芥DIR家族（TpDIR1～TpDIR25）和甜橙DIR家族（CsDIR1～CsDIR33）家族分成6個小組（I～VI），其中I組中包括7個ZpDIR成員：ZpDIR1、ZpDIR8、ZpDIR10、ZpDIR12、ZpDIR13、ZpDIR23、ZpDIR24，而ZpDIR14、ZpDIR17、ZpDIR19、ZpDIR25、ZpDIR28屬于II組，共5個，III組只包含1個ZpDIR成員，即ZpDIR11，VI組中不包含ZpDIR成員，V組中也包括了5個ZpDIR成員：ZpDIR7、ZpDIR18、ZpDIR21、ZpDIR26、ZpDIR27，VI組包含的ZpDIR最多，分別為ZpDIR2、ZpDIR3、ZpDIR4、ZpDIR5、ZpDIR6、ZpDIR9、ZpDIR15、ZpDIR16、ZpDIR20、ZpDIR22共10個成員（圖1） 。

2.3ZpDIR蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

為深入研究ZpDIR蛋白空間結(jié)構(gòu)上的相似性，對ZpDIR家族蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析（表2）。結(jié)果顯示，該蛋白家族在二級結(jié)構(gòu)上的特征略有差異，其中ZpDIR蛋白α螺旋的比例最大的值為32.26%，而最大值卻是8.18%，β折疊比例最大值為8.26%，最小值則是2.04%，由此可知ZpDIR蛋白的α螺旋與β折疊比例差異大，最大最小之間差距約為4倍。延伸鏈的比例范圍在18.41%～39.56%，無規(guī)則卷曲比例偏高，范圍是31.19～至61.45%，延伸鏈與無規(guī)則卷曲最大最小的比例差距較小一些，約為2倍。對ZpDIR蛋白三級（空間）結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)各蛋白三級結(jié)構(gòu)模型大致相似（圖2），除ZpDIR11、ZpDIR24、ZpDIR25的三級結(jié)構(gòu)較為簡單以外，其余蛋白在三級模型上相差不大。對蛋白空間模型的預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)ZpDIR蛋白屬于多鏈線性折疊卷曲蛋白，絕大多數(shù)是線性無鏈非規(guī)則多鏈卷曲蛋白。

2.4ZpDIR家族蛋白結(jié)構(gòu)域序列比對

利用DNAMAN軟件對篩選得到的28條朝倉花椒DIR蛋白的保守結(jié)構(gòu)域序列進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)朝倉花椒DIR家族DIR結(jié)構(gòu)域多個氨基酸位點維持保守不變，因此具有較高保守性（圖3）。

2.5ZpDIR家族蛋白結(jié)構(gòu)保守基序分析

使用在線軟件MEME對28條氨基酸序列的保守基序進行預(yù)測分析（見圖4），除ZpDIR27蛋白由于保守結(jié)構(gòu)域序列過短，沒有找到保守基序以外，其余大多氨基酸保守結(jié)構(gòu)域序列都擁有5種保守基序，這再一次證明了DIR結(jié)構(gòu)域是高度保守的。

3結(jié)論與討論

DIR蛋白是植物木脂素生物合成途徑中的重要參與者之一，調(diào)控著植物木脂素的合成，并參與植物對生物和非生物脅迫的抵御。該家族蛋白結(jié)構(gòu)均含有一個典型的

DIR結(jié)構(gòu)域，? 少數(shù)成員含有兩個串聯(lián)的DIR結(jié)構(gòu)域。有些DIR蛋白還含有其他結(jié)構(gòu)域， 比如C端融合的木菠蘿素類凝集素（Jacalin-related lectin， JRLs）結(jié)構(gòu)域， 該結(jié)構(gòu)域是JRL類凝集素蛋白的典型結(jié)構(gòu)域，同抗病、抗蟲等植物防御體系有密切關(guān)系[13]。已有研究基于基因

組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對小麥[3]、毛竹[14]、

水稻[15]和丹參[16]的

DIR基因家族成員進行鑒定分析，結(jié)果表明，不同物種的DIR家族在成員數(shù)量上、結(jié)構(gòu)域數(shù)量以及類型上和進化模式上都存在著差異。

朝倉花椒是一種重要的經(jīng)濟作物，本實驗室前期對朝倉花椒雌株結(jié)果期幼芽的轉(zhuǎn)錄 組進行測序，經(jīng)拼接比對后，獲得了62150個表達序列標(biāo)簽，以及68315個注釋基因[17]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究通過注釋比對，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選得到28條DIR蛋白的序列。通過生物信息學(xué)分析可知，朝倉花椒的DIR蛋白家族均含有保守的DIR結(jié)構(gòu)域，且多個氨基酸位點相對穩(wěn)定，蛋白家族的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)相對保守，且結(jié)構(gòu)相似。然而，該家族編碼基因大小差異顯著，開放閱讀框最小為120 bp，最大為1209 bp，由此可知朝倉花椒中的

DIR蛋白兼具專一化與多樣化的特征。以朝倉花椒、蒺藜苜蓿、擬南芥和甜橙DIR家族共同構(gòu)建的進化樹將其分成6個小組（I～VI），其中ZpDIR主要集中位于I與VI組，而2、3組主要包含的是MtDIR與CsDIR。有研究顯示，I組被歸為DIR-a亞家族[18]，它包含了朝倉花椒、蒺藜苜蓿、擬南芥以及甜橙4個物種的DIR

基因，其中擬南芥DIR成員最多，為11個，而朝倉花椒、蒺藜苜蓿、以及甜橙的

DIR成員數(shù)量分別為7、4、4個。本研究通過對朝倉花椒

DIR基因家族進行鑒定和分析，對該家族蛋白的基本結(jié)構(gòu)、生化性質(zhì)以及進化關(guān)系等方面有了初步了解，為后期該基因功能的研究提供了理論基礎(chǔ)。

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