周旭凱，田玉紅*，董 菲，陸 苑，陳房姣

1廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院；2廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)部，柳州 545006

廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部用藥，是我國常用的芳香化濕類中藥，味辛，微溫，歸脾、胃、肺三經(jīng)，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑的功效[1]。廣藿香除作為藥用外，從其中提取的廣藿香精油用途也十分廣泛，因其具有濃烈的香味，主要作為化妝品、定香劑和殺蟲劑等日常生活用品的生產(chǎn)配料[2,3]。

廣藿香揮發(fā)性成分的提取一般采用水蒸氣蒸餾工藝，餾出液中的油相部分即為精油，主要成分為廣藿香醇、廣藿香酮[4]。在精油的生產(chǎn)過程中由于精油分子在蒸餾過程中與水蒸氣保持長時間接觸，所以精油中的極性和親水性成分部分地溶入水中，即為精油的水溶性揮發(fā)成分[5]。這部分微溶于水的揮發(fā)性成分，靠單純的力學(xué)手段是不可能將它們充分分離的，而且微溶于水的這部分精油，由于餾出液的油水比小，水溶性揮發(fā)成分在整個餾出精油中所占的比例是相當可觀的。精油植物具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗癌、驅(qū)蚊等多種作用機制[6]，目前有關(guān)廣藿香精油的生物活性的研究報道還不多。本文提取了廣藿香揮發(fā)成分的油相部分和水溶性部分，采用GC-MS進行化學(xué)成分分析，并對其清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力進行了評價，為綜合開發(fā)利用廣藿香資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

廣藿香購自桂林鼎康中藥飲片有限公司，產(chǎn)地廣西，檢驗結(jié)果符合2015版《中國藥典》一部標準規(guī)定。

2，2-二苯基-1-三硝基苯肼自由基(DPPH·)(AR，美國Sigma公司)；2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽自由基(ABTS+·)(AR，美國Adamas公司)；過硫酸鉀(K2SO5)(AR，西隴科學(xué)股份有限公司)；叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,TBHQ)(AR，美國Sigma公司)；丁基羥基茴香醚(butylated hydroxyanisole，BHA)(AR，美國Sigma公司)；廣藿香醇(patchouli alcohol)(97%，上海詩丹德標準技術(shù)有限公司)；廣藿香酮(pogostone)(98%，上海詩丹德標準技術(shù)有限公司)；氯化鈉(NaCl)(AR，廣東光華科技股份有限公司)；乙醚(C4H10O)(AR，四川西隴化工有限公司)；乙醇(C2H6O)(AR，臺山市粵僑試劑塑料有限公司)。

TRACE1300-ISQ QD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5石英毛細色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)(美國安捷倫科技有限公司)；1788揮發(fā)油提取器(湖州申玻儀器有限公司)；722S型可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)。

1.2 試驗內(nèi)容

1.2.1 廣藿香揮發(fā)性成分的提取

廣藿香揮發(fā)性成分油相部分的提取 準確稱取100 g已搗碎的廣藿香，放置于2 000 mL燒瓶中，加入十倍量的水后連接揮發(fā)油提取裝置，采用水蒸氣蒸餾法提取6 h，靜止分層后讀取精油的體積為1.34 mL，稱重為1.31 g，提取率為1.31%。所得的廣藿香精油為淡黃色油狀液體。

廣藿香揮發(fā)性成分水溶性部分的提取 將蒸餾后燒瓶中的剩余殘液過濾，再次進行蒸餾，收集餾出液。將餾出液用NaCl鹽析后用無水乙醚萃取，50 ℃水浴回收乙醚，獲取具有芳香氣味的棕黃色油狀液體即為水溶性揮發(fā)成分，稱重為0.68 g，提取率為0.68%。

1.2.2 GC-MS分析

采用GC-MS對廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分和水溶性成分進行定性定量分析[7]。氣相色譜條件：HP-5毛細管色譜柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm。載氣為高純氦氣，流量1.0 mL/min；進樣量1 μL，分流比1∶150，進樣口溫度280 ℃，接口溫度280 ℃。采用程序升溫：60 ℃保持5 min，升至260 ℃(2 ℃/min)，于260 ℃保持5 min，水溶性揮發(fā)成分溶劑延遲2 min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.5 KV，質(zhì)量掃描范圍50～550 amu，全掃描方式。采用計算機對各峰質(zhì)譜圖進行NIST17標準譜庫的檢索，僅對與NIST17標準譜庫對比的SI或RSI值大于850的物質(zhì)進行探討，參考標準圖譜及質(zhì)譜裂解規(guī)律確定其化學(xué)成分。定量方法采用峰面積歸一法計算各組分的相對百分含量。

1.2.3 DPPH·清除能力的測定

以無水乙醇作為溶劑，配制0.02 mg/mL的DPPH·溶液，避光保存。分別取等體積的樣品溶液與DPPH·溶液充分混勻，確定反應(yīng)時間為1 h，在517 nm處測定其吸光度Ai，以無水乙醇分別代替上述體系中的樣品溶液和DPPH·溶液測定其吸光度為Ac和Aj，實驗重復(fù)三次取平均值[8]。以TBHQ和BHA作為陽性對照。DPPH·清除能力的計算公式為：

式中：Ai為2 mL樣品溶液+2 mLDPPH·的吸光度值；Aj為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度值；Ac為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH·的吸光度值。

1.2.4 ABTS+·清除能力的測定

將7 mmol/L的ABTS+·溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，在常溫下避光保存24 h后得到ABTS+·母液，并用無水乙醇調(diào)節(jié)其濃度，使其在734 nm處吸光度為0.70(±0.002)，獲得ABTS+·工作液。分別取等體積的樣品溶液與ABTS+·工作液混勻，避光6 min后測定其在734 nm處的吸光度值A(chǔ)i，以無水乙醇代替樣品溶液測定其吸光度A0，實驗重復(fù)三次取平均值[9]。以TBHQ和BHA作為陽性對照。ABTS+·清除能力的計算公式為：

式中：A0為2 mL乙醇+2 mLABTS+·的吸光度值；Ai為2 mL樣液+2 mLABTS+·的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析結(jié)果

按“1.2.2”GC-MS測試條件對廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分和水溶性成分進行分析，得到2種組分的總離子流色譜圖。如圖1所示，廣藿香揮發(fā)性成分的油相組分經(jīng)鑒定確認了29個組分的化學(xué)成分，占油相物質(zhì)總含量的84.36%，水溶性部分經(jīng)鑒定確認了28個組分的化學(xué)成分，占水溶性部分總含量的40.72%，結(jié)果如表1，表中各物質(zhì)按照其從HP-5毛細管色譜柱中的流出順序排列。

圖1 廣藿香揮發(fā)性成分的油相組分(A)和水溶性組分(B)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of oil fraction of the volatile compounds(A) and water-soluble fraction of the volatile compounds(B) from Pogostemon cablin(Blanco)Benth.

表1 廣藿香的揮發(fā)性化學(xué)成分Table 1 Chemical constituents of volatile compounds from Pogostemon cablin (Blanco)Benth.

續(xù)表1(Continued Tab.1)

廣藿香揮發(fā)性成分經(jīng)鑒定，油相成分中醇類物質(zhì)的含量最高共6種占總峰面積的37.12%，碳氫化合物的數(shù)量最多共15種占29.55%，酮類物質(zhì)4種占14.79%，環(huán)氧化物1種占2.33%，酸類物質(zhì)1種占0.53%，醛類物質(zhì)1種占0.03%，醚類物質(zhì)1種占0.01%。油相成分中廣藿香醇的含量最高為34.72%，其他質(zhì)量分數(shù)較高的成分依次為廣藿香酮(12.02%)、δ-愈創(chuàng)木烯(7.53%)、西車烯(6.69%)、α-綠葉烯(3.20%)、β-綠葉烯(2.66%)、(-)-莎草奧酮(2.62%)、氧化石竹烯(2.33%)、(1R，4aS，6R，8aS)-8a，9，9-三甲基-1，2，4a，5，6，7，8，8a-八氫-1，6-亞甲基萘-1-醇(2.31%)、環(huán)苜蓿烯(2.04%)、α-愈創(chuàng)木烯(1.81%)、石竹烯(1.77%)。研究表明，廣藿香醇具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、殺蟲、抗動脈粥樣硬化、止吐、增白和鎮(zhèn)靜作用。由于含量相對較多，廣藿香醇在《中國藥典》中被作為分析廣藿香藥材和廣藿香油質(zhì)量的指標成分[10,11]。相關(guān)研究表明廣藿香揮發(fā)性成分在組分上具有一定的相似性，但含量上具有較大差異。Godbol等[3]用GC-MS對廣藿香葉子中提取的精油進行分析，共鑒定出19種化合物，主要為廣藿香醇(30.65%)、α-愈創(chuàng)木烯(10.67%)、β-愈創(chuàng)木烯(9.09%)、石竹烯(8.64%)、二十碳烯(5.27%)。Verma等[5]對廣藿香地上部分(葉，花序和整個地上部分)的油進行分析，發(fā)現(xiàn)主要成分是廣藿香醇(42.2%～57.7%)、α-亞麻油(9.0%～15.2%)、α-愈創(chuàng)木烯(6.4%～17.9%)、西車烯(3.4%～6.9%)、廣藿香奧醇(0.3%～5.0%)和β-石竹烯(2.1%～3.6%)。Wang等[12]利用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對廣藿香揮發(fā)油化學(xué)成分進行分析，鑒定出其中31個化學(xué)成分和各組分的相對含量，主要成分為廣藿香醇(31.66%)、廣藿香酮(23.58%)，其它成分是丁香烯、廣藿香烯、愈創(chuàng)木烯、法尼醇及它們的異構(gòu)體等。這可能是由于生長環(huán)境、氣候條件的差異性所造成的。

鑒定的廣藿香水溶性揮發(fā)成分中除2-乙?；量?0.12%)和3-乙基-4-甲基-1H-吡咯-2,5-二酮(0.27%)2種含量極少的含氮化合物外，其余成分皆為含氧化合物，水溶性成分缺乏疏水性，因而不含萜烯類化合物[13]。水溶性揮發(fā)成分中酮類物質(zhì)9種占29.64%，酸類物質(zhì)5種占6.46%，醇類物質(zhì)4種占2.60%，醛類物質(zhì)6種占1.30%，酚類物質(zhì)2種占0.42%，含氮化合物2種占0.39%，環(huán)氧化物1種占0.18%。相對含量較高的成分有廣藿香酮(21.89%)、紫堇酮(5.76%)、異己酸(2.69%)、己酸(2.09%)，由此可見廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分與油相成分相差很大。相關(guān)研究也表明，從植物中提取的水溶性組分和油相組分的化學(xué)成分不僅在數(shù)量上不同，而且往往在質(zhì)量上也不同[14,15]。廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分中富含廣藿香酮，并且其中廣藿香酮(21.89%)的含量高于油相中廣藿香酮(12.02%)的含量。廣藿香酮是重要的醫(yī)藥及日化原料，作為廣藿香精油的重要組成成分，具有一定的抗氧化作用，因此在化妝品行業(yè)有較好的前景。除此之外廣藿香酮還具有顯著的抗菌、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤、殺蟲等作用[16]。

2.2 廣藿香揮發(fā)性成分對DPPH·的清除效果

DPPH·有單電子，在517 nm處有強吸收，其醇溶液呈紫色。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收減弱，其褪色程度與其接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。圖2為不同濃度下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分、水溶性成分、廣藿香醇、廣藿香酮以及兩種抗氧化劑TBHQ和BHA對DPPH·的清除率。由圖2可知，隨著樣品濃度的增大其對DPPH·清除效果也隨之增強，不同濃度下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分對DPPH·的清除效果呈現(xiàn)量效關(guān)系。表2所示，實驗條件下，反應(yīng)時間為1 h時，廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分清除DPPH·的IC50值分別為6.489 9和0.187 0 mg/mL，廣藿香醇、廣藿香酮清除DPPH·的IC50值分別為8.318 3和5.491 7 mg/mL。

圖2 DPPH·的清除率與濃度之間的關(guān)系Fig.2 DPPH·radical scavenging rate of essential oils at different concentration注：A.廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分；B.廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分；C.廣藿香醇；D.廣藿香酮；E.叔丁基對苯二酚；F.丁基羥基茴香醚，下同。Note：A.Oil fraction of the volatile compounds from P.cablin;B.Water-soluble fraction of the volatile compounds from P.cablin;C.Patchouli alcohol;D.Pogostone;E.tert-Butylhydroquinone;F.Butylated hydroxyanisole,the same below.

2.3 廣藿香揮發(fā)性成分對ABTS+·的清除效果

ABTS+·是一種具有特殊藍綠色且性質(zhì)相對穩(wěn)定的水溶性自由基，可通過K2S2O8氧化ABTS+·獲得。其與具有抗氧化能力的樣品反應(yīng)可使溶液顏色逐漸變淺至無色，且褪色的程度越明顯則其抗氧化能力越強，其特征吸光度值越小[17]。圖3為不同濃度下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分對ABTS+·的清除率。由圖3可知，廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分對ABTS+·的清除率均隨樣品濃度的增大而增大。表2所示，實驗條件下廣藿香揮發(fā)性成分油相成分和水溶性成分清除ABTS+·的IC50值分別為0.998 5和4.662×10-2mg/mL，廣藿香醇、廣藿香酮清除ABTS+·的IC50值分別為2.126 5和16.283 8 mg/mL。表明廣藿香揮發(fā)性成分的水溶性成分清除ABTS+·的能力遠遠強于油相成分，且油相成分和水溶性成分抗氧化能力強于其主要成分廣藿香醇和廣藿香酮。

圖3 ABTS+·的清除率與濃度之間的關(guān)系Fig.3 ABTS+·radical scavenging rate of essential oils at different concentration

表2 廣藿香揮發(fā)性成分的抗氧化活性Table 2 Antioxidant activity of volatile components of Pogostemon cablin (Blanco)Benth.

相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，植物揮發(fā)性成分的水溶性成分的抗氧化能力優(yōu)于油相成分，Rania等[15]采用DPPH·清除法和β-胡蘿卜素法的抗氧化實驗結(jié)果表明金盞花的水溶性揮發(fā)成分的抗氧化能力大大強于油相成分。Sanja等[18]的實驗結(jié)果也證實從天竺葵莖和葉子中提取的水溶性揮發(fā)成分清除DPPH·的能力也優(yōu)于油相成分。Shen等[19]發(fā)現(xiàn)檳榔和椰子的花、莖、根的水溶性揮發(fā)成分對DPPH·和ABTS+·均有良好的清除作用，實驗結(jié)果顯示水溶性揮發(fā)成分的抗氧化能力與酚的含量密切相關(guān)，酚類物質(zhì)的含量越高，抗氧化能力越強。在鑒定確認的廣藿香水溶性揮發(fā)成分中含有4-甲氧基苯酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚兩種酚類物質(zhì)，雖然含量較低，但在抗氧化活性中可能起著主要作用[20,21]。而在廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分中不含酚類物質(zhì)，因此廣藿香水溶性揮發(fā)成分對DPPH·和ABTS+·的清除能力都強于油相成分，這也與相關(guān)的研究結(jié)果相符。

3 結(jié)論

分別提取了廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分和水溶性成分，分別采用GC-MS聯(lián)用法進行了定性定量分析。鑒定的廣藿香揮發(fā)性成分的油相成分中廣藿香醇的含量最高為34.72%，其他質(zhì)量分數(shù)較高的成分依次為廣藿香酮(12.02%)、δ-愈創(chuàng)木烯(7.53%)、西車烯(6.69%)。與油相成分不同，鑒定確認的水溶性成分中主要為含氧化合物，不含萜烯化合物，主要成分為廣藿香酮(21.89%)、紫堇酮(5.76%)。通過DPPH·清除法和ABTS+·清除法測定出廣藿香揮發(fā)性成分中的油相成分和水溶性成分均具有較好的清除自由基的活性，研究結(jié)果還表明水溶性揮發(fā)成分對DPPH和ABTS自由基清除能力遠遠強于油相成分。綜上所述，作為天然自由基清除劑和抗氧化劑來源，廣藿香揮發(fā)性成分在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)中具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。