凌智輝，肖 蓓，岳芊羽，歐梓軒，謝紅旗,2，曾建國(guó),2，陸 英,2*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院；2國(guó)家中藥材生產(chǎn)(湖南)技術(shù)中心，長(zhǎng)沙 410128

荷葉是睡蓮科蓮NelumbonuciferaGaertn.的葉，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為,荷葉味苦性平，歸肝、脾、胃三經(jīng),具有清解暑熱、升發(fā)清陽(yáng)、涼血止血的作用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為荷葉有抑菌[1,2]、抗病毒[3,4]、抗氧化[5,6]、降血糖[7]、降脂減肥[8,9]、抗癌[10,11]等多種功能，被國(guó)家衛(wèi)生部列入藥食同源目錄中。研究人員從荷葉中分離鑒定了多個(gè)黃酮類和生物堿類化合物，然而，2015版《中國(guó)藥典》中對(duì)荷葉質(zhì)量要求僅為荷葉堿>0.1%；同時(shí)，查閱文獻(xiàn)可知，不同產(chǎn)地初加工方法對(duì)荷葉中黃酮類化合物含量影響鮮見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

鑒于黃酮類化合物的多種生物活性，筆者認(rèn)為，增加對(duì)荷葉中主要黃酮類的含量測(cè)定更有利于其質(zhì)量保證。因此，為進(jìn)一步探明荷葉中主要黃酮類化合物的組成，本研究首先采用高速逆流色譜與制備液相聯(lián)用技術(shù)對(duì)荷葉提取液中3個(gè)主要黃酮類化合物進(jìn)行分離，并經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振技術(shù)分別鑒定為金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，這些成分具有重要的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血糖、降脂等[12,14]，是荷葉功能的物質(zhì)基礎(chǔ)；然后實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以該3個(gè)化合物及荷葉堿為指標(biāo)，對(duì)荷葉不同干燥方法及采收時(shí)間進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確不同加工方法對(duì)荷葉品質(zhì)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)荷葉開(kāi)發(fā)利用及生產(chǎn)實(shí)踐具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

化合物制備分離所用干燥荷葉原料購(gòu)自養(yǎng)天和大藥房湖南農(nóng)大店；產(chǎn)地初加工荷葉鮮樣采自湖南長(zhǎng)沙湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)寸草湖，經(jīng)湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)謝紅旗教授鑒定為睡蓮科植物蓮NelumbonuciferaGaertn.的葉；色譜純乙腈購(gòu)于美國(guó)天地公司；荷葉堿(純度98%)購(gòu)于中山市成諾生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SPD-M20A分析型高效液相色譜儀(日本島津公司)；TBE-300A高速逆流色譜儀(中國(guó)上海同田生化技術(shù)有限公司)；LC-8A制備高效液相色譜儀(日本島津公司)；MODULYOD-230冷凍干燥機(jī)(美國(guó)熱電公司)；Milli-Q Reference超純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)；AUW220D電子天平(日本島津公司)。

1.3 方法

1.3.1 荷葉提取物中活性成分的HPLC分析方法

采用WondasilTMC18柱(4.6 × 250 mm)；流動(dòng)相A：0.2%磷酸水，B：乙腈，梯度洗脫方法為：0～20 min：15%( 28% B；20 ～ 25 min：28%( 40% B；流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.3.2 3個(gè)荷葉黃酮化合物的分離制備

取購(gòu)買的干燥荷葉500 g，粉碎，用5 000 mL 40%乙醇35 ℃超聲浸提1.0 h，過(guò)濾，濾渣同法再提取1次，合并濾液，55 ℃真空濃縮除去乙醇，得荷葉粗提液2 200 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值3左右，以3 BV/h流速通過(guò)一支裝有500 mLAB-8大孔吸附樹(shù)脂的層析柱，上樣完成后靜置30 min，水洗至流出液無(wú)色，然后用體積濃度70%乙醇以3 BV/h流速洗脫，收集洗脫液，真空濃縮后冷凍干燥，得荷葉黃酮提取物17 g，作為高速逆流色譜分離的上樣原料。

按正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-0.2%冰乙酸水溶液(1∶3∶2∶1∶4，V/V)擴(kuò)大200倍配制成2 200 mL的溶劑體系，靜置過(guò)夜后將上下相分離，分別超聲脫氣10 min。上相為固定相，下相為流動(dòng)相，正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速850 rpm，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,溫度20 ℃，儀器平衡后取上述制備的樣品300 mg用下相20 mL溶解進(jìn)樣，進(jìn)樣后采集色譜圖。根據(jù)色譜圖收集流分A(188～220 min)和流分B(235～258 min)；將流分B濃縮后用少量甲醇溶解，以乙腈和0.2%冰乙酸水為流動(dòng)相，20%乙腈等度洗脫，流速6.0 mL/min,分別收集色譜峰1(33～35 min)和色譜峰2(36～38 min)；將色譜峰1、2流出液和流分A分別濃縮后冷凍干燥，得化合物1、2、3。

1.3.3 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

采用質(zhì)譜(MS)、核磁共振(1H NMR和13C NMR)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。質(zhì)譜在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)分析測(cè)定中心完成，核磁共振譜在湖南師范大學(xué)化工研究院分析測(cè)試中心完成，溶劑為DMSO。

1.3.4 不同干燥方法及采收時(shí)間對(duì)荷葉中黃酮和荷葉堿的含量影響研究

1.3.4.1 樣品制備

處理1：三種干燥方式樣品制備：取同一池塘相鄰生長(zhǎng)的大小相同9片荷葉分為三組，每組3片，分別采用曬干、陰干、60 ℃烘干三種干燥方式，各組樣品干燥后分別粉碎，混勻，過(guò)30目篩網(wǎng)。

處理2：不同烘干溫度樣品制備：取同一池塘相鄰生長(zhǎng)的大小相同的5片荷葉，每片分成6 等份，分別在50、60、70、80、90、100 ℃下烘干；同溫度的干燥樣品粉碎后混勻，過(guò) 30目篩網(wǎng)。

處理3：烘干前切制與不切制樣品制備：取3片大小相同的荷葉，每片對(duì)折分成2份，一份切成1.5 cm的條狀，另一份不切，在60 ℃下烘干；切制樣品與不切制樣品分別粉碎后混勻，過(guò)30 目篩網(wǎng)；。

處理4：不同采收時(shí)間樣品制備：分別在7、8、9月中旬采收3片大小相同的荷葉，60 ℃下烘干，粉碎后混勻，過(guò)30目篩網(wǎng)。

1.3.4.2 樣品含量測(cè)定

分別精確稱取一定量上述自制干燥化合物1、2、3和荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇超聲溶解，配制成1 mg/mL左右的母液，臨用前用甲醇對(duì)倍稀釋至一系列濃度，在“1.3.1”條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。以化合物質(zhì)量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以噪音峰高3 倍為最低檢出限。

精密稱取不同干燥處理的荷葉樣品0.25 g，加入100 mL質(zhì)量濃度為40%的乙醇，置于55 ℃超聲提取30 min，提取完畢后用提取液補(bǔ)充至超聲前質(zhì)量，搖勻后取上清液過(guò)0.45 μm有機(jī)濾膜，測(cè)定目標(biāo)組分峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中各組分含量，并根據(jù)含水量換成干品含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷葉中活性成分HPLC分析方法的確定

荷葉提取液的HPLC見(jiàn)圖1左，由圖可知，色譜峰1、2、3較高，DAD檢測(cè)器顯示它們?cè)?54 nm、350 nm處有較大吸收，為黃酮苷類化合物吸收特征，確定為待分離的目標(biāo)組分，色譜峰4與荷葉堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致，確定為荷葉堿。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同型號(hào)的色譜柱對(duì)荷葉中黃酮類化合物的分離效果有很大的影響。采用Agilent ZORBAX SB C18柱時(shí)化合物2和3完全不能分離(圖1右)，改為WondasilTMC18色譜柱時(shí)兩者才有一定程度的分離(圖1左)，因此，最終采用GL Science WondasilTMC18進(jìn)行分析。

圖1 荷葉提取物在不同型號(hào)色譜柱HPLC圖Fig.1 HPLC analysis of extract from lotus leaf in different chromatographic columns

2.2 荷葉中3個(gè)主要黃酮類化合物的制備分離

通過(guò)HPLC測(cè)定目標(biāo)組分的分配系數(shù)(K值)是選擇HSCCC分離溶劑體系的常用方法，不同化合物間的K值相差較大，表示化合物之間的分離度越好，K值越接近，表示難以分離。3個(gè)目標(biāo)組分在多種不同組成的溶劑體系的K值后發(fā)現(xiàn)，K1、K2總是很接近，K3與K1、K2相差較大，即HSCCC難以將化合物1與2分離，但二者都能與化合物3分離；同時(shí)，HPLC分析顯示，化合物1與2在液相色譜柱中具有一定的分離度。因此，實(shí)驗(yàn)最終確定，首先通過(guò)HSCCC分離獲得化合物3及化合物1、2的混合溶液，再通過(guò)制備液相分離化合物1、2。

實(shí)驗(yàn)采用正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-甲醇-0.2%冰乙酸水溶液(1∶3∶2∶1∶4，V/V)為溶劑體系進(jìn)行分離，在該體系中K1、K2、K3分別為3.02、3.20、4.20。HSCCC圖譜見(jiàn)圖2，得到流分A和流分B，不同流分的HPLC測(cè)定見(jiàn)圖3，由圖可見(jiàn)，流分A為化合物3，面積歸一法測(cè)定純度為98.78%，真空濃縮冷凍干燥后得到干粉12.06 mg。流分B中為化合物1、2的混合物，該流分經(jīng)制備液相分離，結(jié)果見(jiàn)圖4，得到5.19 mg純度為98.36%的化合物1和4.23 mg純度為96.68%的化合物2。

圖2 HSCCC分離荷葉黃酮Fig.2 Separation of flavonoids from lotus leaves by HSCCC

圖3 HSCCC分離流分A和流分B的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of elute A and elute B separated by HSCCC

圖4 制備HPLC分離流分B及分離物的HPLC圖Fig.4 Chromatograms of elute B and isolates separated by Pre-HPLC

2.3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1黃綠色粉末，Q-TOF-MS分析化合物的[M+H]+為m/z465.102 0，提示分子式為C21H20O12。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.40(1H，d，J= 2.0 Hz，Glc H-1′′)，6.20(1H，s，H-6)，6.43(1H，s，H-8)，6.84(1H，d，J= 7.5 Hz，H-5′)，7.58(1H，s，H-2′)，7.65(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6′)，12.65(1H，s，5-OH)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：177.9(C-4)，165.9(C-7)，161.6(C-5)，156.6(C-2，C-9)，149.3(C-4′)，145.6(C-3′)，133.7(C-3)，122.1(C-6′)，121.4(C-1′)，116.5(C-5′)，115.7(C-2′)，103.8(C-10)，102.2(C-1′′)，99.4(C-6)，94.1(C-8)，76.3(C-5′′)，73.7(C-3′′)，71.7(C-2′′)，68.3(C-4)，60.5(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，確定為金絲桃苷。

化合物2黃綠色粉末，Q-TOF-MS分析化合物的[M-H]-為m/z463.088 3，提示分子式為C21H20O12。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.48(1H， d，J=4.5 Hz，Glc H-1′′)，6.20(1H，s，H-6)，6.42(1H，s，H-8)，6.84(1H，d，J=7.0 Hz，H-5′)，7.59(1H，s，H-6′，H-2′)，8.33(1H，s，3′-OH)，12.6(1H，s，5-OH)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：94.3(C-8)，99.24(C-6)，104.2(C-10)，115.7(C-2′)，116.6(C-5′)，121.6(C-6′)，121.9(C-1′)，133.6(C-3)，145.39(C-3′)，149.1(C-4′)，156.5(C-9)，156.8(C-2)，161.6(C-5)，165.1(C-7)，177.8(C-4)，101.2(Glc-1′)，74.5(Glc-2′′)，76.9(Glc-3′′)，70.3(Glc-4′′)，78.1(Glc-5′′)，61.4(Glc-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]報(bào)道基本一致，確定為異槲皮苷。

化合物3黃棕色粉末，Q-TOF-MS分析化合物的[M-H]-為477.048 6，提示分子式為C21H18O13。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：3.27～3.40(3H，m，2′′，3′′，4′′-H)，3.58(1H，d，J= 9.5 Hz，5′′-H)，5.51(1H，d，J= 7.5 Hz，1′′-H)，6.21(1H，d，J= 2.0 Hz，6-H)，6.41(1H，d，J= 2.0 Hz，8-H)，6.84(1H，d，J= 8.5 Hz，6′-H)，7.53(1H，d，J= 2.0 Hz，2′-H)，7.61(1H，d，J= 2.0 Hz，6′-H)，12.57(1H，s，5-OH)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：156.7(C-2，C-9)，133.6(C-3)，177.6(C-4)，161.6(C-5)，99.3(C-6)，164.6(C-7)，94.1(C-8)，104.3(C-10)，121.3(C-1′)，115.7(C-2′)，145.4(C-3′)，149.1(C-4′)，116.6(C-5′)，122.1(C-6′)，101.6(C-1′′)，74.3(C-2′′)，76.4(C-3′′)，71.8(C-4v)，80.8(C-5′′)，170.4(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17,18]報(bào)道基本一致,鑒定為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。

2.4 不同干燥方法及采收時(shí)間對(duì)荷葉黃酮及荷葉堿含量影響

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，3個(gè)黃酮類化合物和荷葉堿的質(zhì)量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，可以用于含量測(cè)定。

表1 4個(gè)化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Standard curve of 4 compounds

2.4.2 干燥方式對(duì)荷葉中活性成分的影響

整片曬干、陰干和60 ℃烘干處理樣品中4個(gè)化合物的含量見(jiàn)表2，由表可見(jiàn)，三個(gè)黃酮類化合物以槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷含量最高，約為金絲桃苷的5倍，異槲皮苷的14倍；不同干燥方式樣品中黃酮總量為：60 ℃烘干(陰干(曬干，其中60 ℃烘干與曬干、陰干具有顯著性差異，而曬干與陰干無(wú)顯著性差異；三種處理樣品中荷葉堿含量相近，不具有顯著性差異?？傮w來(lái)說(shuō)，烘干優(yōu)于陰干和曬干，陰干與曬干相差不大。

表2 干燥方式對(duì)荷葉中活性成分的影響Table 2 Effect of drying methods on activity compounds in lotus leaves (%)

2.4.3 烘干溫度對(duì)荷葉中活性成分的影響

不同烘干溫度處理的樣品中各化合物含量見(jiàn)表3，隨著烘干溫度升高，4個(gè)化合物含量呈上升趨勢(shì)，分為具有顯著性差異的三個(gè)等級(jí)，黃酮含量50～80 ℃最低，90 ℃居中，100 ℃最高；荷葉堿含量50 ℃最低，60～90 ℃居中，100 ℃最高。由此可見(jiàn)，隨溫度升高，荷葉黃酮和荷葉堿活性成分的保留。可能是低溫干燥時(shí)，酶具有一定活性，同時(shí)時(shí)間長(zhǎng)，干燥過(guò)程前期處于濕熱環(huán)境，使黃酮和荷葉堿發(fā)生部分降解與轉(zhuǎn)化，含量降低；相反，高溫時(shí)，酶快速失活，同時(shí)干燥時(shí)間短，水分快速失去，能減少化合物降解與轉(zhuǎn)化。由此可見(jiàn)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的干燥溫度范圍內(nèi)，高溫短時(shí)的干燥工藝有利于有效成分的保留，研究結(jié)果與文獻(xiàn)[19]的牡丹花瓣總黃酮和文獻(xiàn)[20]中的黃連總生物堿的干燥結(jié)果相似。

表3 烘干溫度對(duì)荷葉中活性成分的影響 Table 3 Effect of drying temperature on activity compounds in lotus leaves (%)

2.4.4 切制對(duì)荷葉中活性成分的影響研究

干燥前趁鮮切制與不切制對(duì)4個(gè)化合物的影響見(jiàn)表4，結(jié)果表明：不切制樣品中總黃酮含量顯著高于切制處理，且主要源于槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的差異；切制與不切制對(duì)荷葉堿含量無(wú)影響。

表4 加工切制對(duì)荷葉中活性成分的影響Table 4 Effects of cutting on activity compounds in lotus leaves (%)

2.5 采收時(shí)間對(duì)荷葉中活性成分的影響

不同采收時(shí)間的荷葉各組分含量見(jiàn)表5，由表可見(jiàn)，從7月到9月，荷葉總黃酮含量趨于穩(wěn)定，9月中旬略有下降，但無(wú)顯著差異；荷葉堿呈上升趨勢(shì)，8月與9月樣品無(wú)顯著差異，但它們與7月有顯著差異。同時(shí)可見(jiàn)，三個(gè)黃酮化合物，因此，綜合黃酮總量與荷葉堿含量，8月中旬到9月中旬為荷葉較佳采收時(shí)間。

表5 采收時(shí)間對(duì)荷葉中活性成分的影響Table 5 Effects of harvest season on activity compounds in lotus leaves (%)

3 結(jié)果與討論

采用HSCCC和制備液相聯(lián)用方法對(duì)荷葉中3個(gè)含量較高的黃酮類化合物進(jìn)行制備分離，經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振鑒定分別為金絲桃苷、異槲皮苷和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷，它們具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血壓、降血糖、降脂等多種重要的生物活性，是荷葉功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此對(duì)這些活性成分進(jìn)行含量測(cè)定對(duì)荷葉加工及開(kāi)發(fā)利用具有重要意義。

不同的干燥方法對(duì)中藥材中活性成分的影響主要在于溫度，溫度一方面影響植物鮮樣中多種酶的活性，另一方面影響活性成分的穩(wěn)定性。高溫對(duì)化合物的影響是雙向的，一方面能快速使酶失活，減少干燥時(shí)間，有利于活性成分的保留，另一方面高溫又會(huì)使一些不穩(wěn)定成分降解變化，不利于活性成分的保留；因此，研究不同中藥材適宜的干燥方法對(duì)保證中藥材質(zhì)量具有重要作用。本研究結(jié)果表明，烘干顯著優(yōu)于陰干和曬干，陰干和曬干無(wú)差異；隨著烘干溫度的升高，各組分含量有上升趨勢(shì)，100 ℃烘干時(shí)含量最高，推測(cè)高溫使酶快速失活能有效地少活性成分的降解與轉(zhuǎn)化；同時(shí)，切制時(shí)會(huì)導(dǎo)致部分酶與化合物充分接觸，使化合物降解，含量下降，但對(duì)不同化合物影響不一致，切制后干燥的總黃酮顯著低于不切制干燥，對(duì)荷葉堿含量無(wú)影響；總體來(lái)說(shuō)，荷葉干燥方法以整塊高溫烘干最好，但無(wú)論哪種干燥方式，荷葉堿含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于2015版《中國(guó)藥典》要求。同時(shí)，從7月到9月，荷葉總黃酮趨于穩(wěn)定，荷葉堿呈上升趨勢(shì)，綜合黃酮總量與荷葉堿含量，8月和9月為荷葉較佳采收時(shí)間。