蘇 瑩，杜 強(qiáng)，郭崇炎，周 敏，石偉杰，趙 瓊，吳小雨，王志龍，陳秋紅

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，水稻油菜抗病育種湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.贛州市花卉研究所，江西 贛州 341413)

磷(P)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中必不可少，在植物細(xì)胞中，磷以磷酸鹽的形式存在，或與有機(jī)化合物結(jié)合，形成核苷酸、磷酸化代謝產(chǎn)物、磷脂等。擬南芥質(zhì)體內(nèi)膜上的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(pPT：Plastic Phosphate translocator)，是以無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)或磷酸化的C3、C5、C6化合物作為底物的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。通過利用pPT-cDNA序列進(jìn)行同源比對(duì)，在擬南芥中找到了大量磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因(PTh)，這些相關(guān)磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PTs：Phosphate translocators)對(duì)于維持細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中Pi的穩(wěn)態(tài)，并嚴(yán)格完成Pi與磷酸化中間體交換的反應(yīng)至關(guān)重要[1-2]。根據(jù)pPT蛋白的底物特異性和序列同源性，可將其分為4個(gè)不同的亞家族，分別是TPT(Triose phosphate/phosphate translocator)[3]、XPT(Xylulose 5-phosphate/phosphate translocator)[4]、GPT(Glucose 6-phosphate/phosphate translocator)[5]和PPT(Phosphoenolpyruvate/phosphate translocator/PT)[6]，其中TPT介導(dǎo)以磷酸三糖和3-磷酸甘油酸酯(3-PGA)形式的固定碳從葉綠體到細(xì)胞質(zhì)的輸出。TPT也是第一個(gè)在分子水平上鑒定到的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。Takemoto 等[7]對(duì)磷酸三糖/磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(TPT)進(jìn)行了一系列全原子分子動(dòng)力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)運(yùn)體將葉綠體基質(zhì)中的有機(jī)磷酸鹽嚴(yán)格地與無(wú)機(jī)磷酸鹽進(jìn)行反向交換。

細(xì)胞壁是植物區(qū)分于動(dòng)物的主要結(jié)構(gòu)之一，對(duì)植物不僅具有保護(hù)和支持作用，還與植物細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)傳導(dǎo)等生理功能有關(guān)。細(xì)胞壁的組成結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜多樣，主要由各類多糖物質(zhì)組成。大多數(shù)細(xì)胞壁非纖維素多糖分子的合成部位是高爾基體，合成所用底物是核苷酸單糖，而核苷酸單糖主要產(chǎn)生于細(xì)胞質(zhì)溶膠，之后再被運(yùn)輸至高爾基體用于合成各類非纖維素多糖分子。核苷酸糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Nucleotide sugar transportors，NSTs)則扮演著將核苷酸單糖從細(xì)胞質(zhì)溶膠運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中的重要角色[8-9]。NSTs目前在部分真核生物中有所發(fā)現(xiàn)。因?yàn)镹STs將核苷酸單糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中的同時(shí)從高爾基體中輸出核苷一磷酸，因此它們也屬于逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

pPT、PTh與NSTs都屬于DMT(Drug/metabolite transportor，藥物/代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)超家族，且pPT、PTh蛋白與NSTs蛋白的結(jié)構(gòu)具有較高的相似性，在多個(gè)氨基酸殘基部位具有較高的保守性，所以將pPT、PTh與NSTs蛋白統(tǒng)稱為TPT/NST家族蛋白[2]。目前，擬南芥基因組被預(yù)測(cè)至少編碼50個(gè)TPT/NST家族成員，而水稻基因組至少編碼53個(gè)TPT/NST家族成員[8，10]。這些家族中的大部分成員功能未知，但也有部分成員的功能已被揭示。擬南芥中的AtNST-KT1蛋白被證實(shí)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)UDP-半乳糖，而不轉(zhuǎn)運(yùn)其他形式的核苷酸單糖[10]。Bakker等[11]利用UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞進(jìn)行功能互補(bǔ)試驗(yàn)，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)并克隆了2個(gè)能夠轉(zhuǎn)運(yùn)UDP-半乳糖的基因UDP-GalT1和UDP-GalT2。Norambuena等[12]在煙草和釀酒酵母中證實(shí)擬南芥AtUTr2蛋白可以特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)UDP-半乳糖，并且定位于高爾基體，推測(cè)其可能在擬南芥半乳糖的糖綴合物合成中起重要作用。Norambuena等[13]克隆了擬南芥中的AtUTr1基因，該基因編碼一種類似于核苷酸單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜疏水蛋白，并在釀酒酵母中被驗(yàn)證能夠轉(zhuǎn)運(yùn)UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖。Reyes等[14]發(fā)現(xiàn)擬南芥的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要通過AtUTr1和AtUTr3蛋白吸收UDP-葡萄糖，并且當(dāng)細(xì)胞積累錯(cuò)誤折疊蛋白的時(shí)候，AtUTr1和AtUTr3蛋白參與向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中運(yùn)輸U(kuò)DP-葡萄糖。當(dāng)同時(shí)敲除AtUTr1和AtUTr3基因時(shí)，擬南芥的雄配子和雌配子均發(fā)育異常。擬南芥AtUTr7蛋白定位于高爾基體，在煙草和酵母表達(dá)系統(tǒng)中，AtUTr7蛋白被證實(shí)可以轉(zhuǎn)運(yùn)UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖，而不轉(zhuǎn)運(yùn)其他形式的核苷酸單糖。在高濃度蔗糖培養(yǎng)條件下，AtUTr7基因缺失的擬南芥突變體植株表現(xiàn)出側(cè)根的早期增殖以及根毛變形。此外，與野生型相比，突變體的側(cè)向根尖中低甲酯化的半乳糖醛酸聚糖的分布有差異[15]。擬南芥GONST1基因編碼核苷酸單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用酵母缺失突變體證實(shí)GONST1蛋白具有轉(zhuǎn)運(yùn)GDP-甘露糖的活性，并且定位于高爾基體[16]。除GONST1外，擬南芥中還鑒定了多個(gè)GONST同源基因，包括GONST2、GONST3、GONST4、GONST5。利用酵母缺失突變體，證實(shí)GONST2與GONST1具有相似的轉(zhuǎn)運(yùn)GDP-甘露糖的活性，而GONST3、CONST4、CONST5轉(zhuǎn)運(yùn)GDP-甘露糖的活性較弱[17]。后來經(jīng)Rautengarten等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，GONST4能夠特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)GDP-巖藻糖，而非GDP-甘露糖，并將它重新命名為GDP-fucose transporter 1 (GFT1)。Ebert等[19]在擬南芥中鑒定了3個(gè)定位于高爾基體的UDP-木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白UXT1～UXT3，UXT1除定位于高爾基體外，還定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，UXT1基因的突變將導(dǎo)致擬南芥莖稈細(xì)胞壁的木糖含量比野生型減少30%。Seino等[20]通過同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在水稻中具有多個(gè)編碼UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因序列，并克隆了其中4個(gè)成員，分別命名為OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3、OsUGT4。利用UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性不足的Lec8細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)表達(dá)OsUGT1、OsUGT2、OsUGT3能夠恢復(fù)Lec8細(xì)胞的缺陷表型，而表達(dá)OsUGT4不能恢復(fù)其表型；利用酵母表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)OsUGT4是UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而不是UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。水稻OsNST1蛋白在酵母缺失突變體中被證實(shí)具有轉(zhuǎn)運(yùn)UDP-葡萄糖的功能，定位于高爾基體，OsNST1基因的突變導(dǎo)致水稻莖稈纖維素含量下降、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)改變，從而造成植株機(jī)械強(qiáng)度減弱，研究表明，OsNST1蛋白為形成基質(zhì)多糖提供糖基底物，從而調(diào)節(jié)纖維素的生物合成[21]。Rautengarten等[8]在擬南芥中識(shí)別和表征了6個(gè)雙功能UDP-L-鼠李糖(Rha)/UDP-D-半乳糖(Gal)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為URGT(AtURGT1～AtURGT6)，2019年P(guān)arra-Rojas等[22]發(fā)現(xiàn)AtURGT2基因與擬南芥種子表皮黏液的形成有關(guān)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)NSTs還可以轉(zhuǎn)運(yùn)核苷硫酸鹽[23]。

基于核苷酸單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NST)在植物中的重要性，本研究利用6個(gè)擬南芥UDP-鼠李糖/UDP-半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白序列(AtURGT1～AtURGT6)，在水稻中比對(duì)到1個(gè)具有相同結(jié)構(gòu)域的基因(LOC_Os02g40090)，其與擬南芥中的AtURGT5(At4G09810)和AtURGT6(At1G34020)基因高度同源[8]，將其命名為OsURGT1。OsURGT1基因編碼的蛋白OsURGT1含有TPT/NST結(jié)構(gòu)域。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)OsURGT1基因的結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件、編碼蛋白的氨基酸組成、親/疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析；通過激素處理和非生物脅迫處理水稻幼苗，探索OsURGT1基因在多種激素和逆境處理?xiàng)l件下的響應(yīng)表達(dá)情況，從而推測(cè)其可能參與的生物學(xué)功能。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

本試驗(yàn)所用的水稻材料為秈型常規(guī)水稻T98B，種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)樓。提取水稻RNA的試劑分別為TRIzol(Thermo Scientific公司)、無(wú)水乙醇、異丙醇和三氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán))、DEPC水(生工生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit with dsDNase(Thermo Scientific公司)；qPCR試劑盒為MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix(High ROX)(莫納生物科技有限公司)；處理的激素有ABA、GA、SA、Eth、MeJA、2，4-D(Sigma公司)；非生物脅迫處理所需試劑有PEG4000、CdCl2、NaCl、H2O2和硝酸鈣(國(guó)藥集團(tuán))；水稻幼苗水培試劑為霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液固體粉末(Coolaber公司)。

1.2 水稻水培營(yíng)養(yǎng)液配制

取霍格蘭固體粉末1.26 g，溶解于1 000 mL的蒸餾水中，另外加入0.945 g硝酸鈣共同溶解，高溫高壓滅菌后備用。

1.3 TRIzol法提取水稻RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA

取水稻組織樣品50 mg，在預(yù)冷研缽中用液氮迅速研磨成粉。打冰備用，將研磨完的組織粉末分別各加入1 mL的TRIzol，旋渦振蕩后置于冰上靜置5 min，低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min)10 min后，吸取上清至新的1.5 mL離心管中，并加入三氯甲烷，混勻后冰上靜置5 min，低溫(4 ℃)離心(12 000 r/min)10 min后，吸取上清至新的1.5 mL離心管中，并加入異丙醇，輕緩混勻后冰上靜置5 min，低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min)10 min后，倒掉上清，加入500 μL 75%乙醇，混勻后，低溫(4 ℃)離心(10 000 r/min)5 min，倒掉上清，室溫放置2 min，加入DEPC水于55 ℃溶解RNA，溶解3 min后保存于-80 ℃冰箱備用。

反轉(zhuǎn)錄前先配置DNA消化反應(yīng)體系。在干凈的PCR管中加入1 μg的RNA、1 μL的dsDNase和1 μL的10×dsDNase Buffer，并加DEPC水補(bǔ)充到10 μL體積，之后37 ℃溫育2 min，加入1 μL 10 mmol/L DTT。然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。在以上消化好的11 μL RNA模板中分別加入1 μL的100 μmol/L Oligo(dT)18Primer、1 μL的10 mmol/L dNTP Mix、4 μL 5×RT Buffer和1 μL的Maxima H Miuns Enzyme Mix，最后補(bǔ)充2 μL 的DEPC水，混勻于50 ℃溫育30 min，85 ℃溫育5 min。

1.4 qRT-PCR反應(yīng)

設(shè)計(jì)特異性良好的qRT-PCR引物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在80～200 bp，引物長(zhǎng)度為18～25 bp。qRT-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建，在干凈的PCR管中加10 μL MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix，0.4 μL的上引(下引)，cDNA模板為2 μL(cDNA原液稀釋10倍)，最后加DEPC水補(bǔ)充到20 μL。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam工具(https：//web.expasy.org/protparam/)分析OsURGT1蛋白的氨基酸組成及理化性質(zhì)；利用ExPASy-ProtScale工具(https：//web.expasy.org/protscale/)分析OsURGT1蛋白的親/疏水性。利用軟件TMHMM Server v.2.0對(duì)OsURGT1蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。使用軟件GOR4、Phyre2預(yù)測(cè)OsURGT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中通過同源比對(duì)，選擇16個(gè)與OsURGT1蛋白高度同源的物種蛋白，運(yùn)用Mega 6.06軟件對(duì)這些蛋白以臨近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行分析。運(yùn)用在線網(wǎng)站Exon-Intron Graphic Maker(http：//www.wormweb.org/exonintron)對(duì)OsURGT1基因進(jìn)行內(nèi)含子和外顯子分析。利用 Plant CARE 在線網(wǎng)站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)對(duì)OsURGT1基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析。

1.6 OsURGT1基因在水稻中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析

取三葉期水稻的根、葉片，成熟期的根、莖、葉、葉鞘、穗，用于OsURGT1基因的組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析。將三葉期水稻幼苗在20% PEG4000(干旱)、100 mmol/L H2O2(氧化)、42 ℃(高溫)、4 ℃(低溫)、0.15 mol/L NaCl(鹽)、0.3 mmol/L CdCl2(鎘)等逆境條件下處理，處理不同時(shí)間段后，取地上部分組織樣品，提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)OsURGT1基因?qū)τ诟鞣巧锩{迫處理的響應(yīng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜。將三葉期水稻幼苗分別用ABA(脫落酸)、GA(赤霉素)、SA(水楊酸)、MeJA(茉莉酸甲酯)等激素進(jìn)行處理(所有激素的終濃度為0.1 mmol/L)，處理不同時(shí)間段后，取地上部分組織樣品，抽提RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)OsURGT1基因?qū)τ诩に卣T導(dǎo)處理的響應(yīng)表達(dá)譜。用于qRT-PCR反應(yīng)的引物序列見表1。以水稻泛素基因Ubiquitin(LOC_Os03g13170)為內(nèi)參基因。

表1 水稻OsURGT1基因表達(dá)量分析相關(guān)引物Tab.1 Primers for gene expression analysis of OsURGT1 in rice

2 結(jié)果與分析

2.1 OsURGT1基因的獲得

通過序列同源比對(duì)，最終從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)中找到OsURGT1基因，全長(zhǎng)為3 421 bp，外顯子和內(nèi)含子分析結(jié)果見圖1，共有5個(gè)外顯子?；蛉L(zhǎng)CDS為996 bp，編碼331個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)(圖2)。該基因長(zhǎng)度符合NST蛋白的特征，具有300～400個(gè)氨基酸殘基。

圖1 水稻OsURGT1基因的結(jié)構(gòu)Fig.1 Gene structure of OsURGT1 in Oryza sativa

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1OsURGT1基因編碼蛋白的氨基酸組成分析OsURGT1基因編碼蛋白OsURGT1的相對(duì)分子質(zhì)量為36 397.18 ku，其分子式為C1685H2654N420O441S17，等電點(diǎn)為9.57，其中帶負(fù)電荷的氨基酸殘基個(gè)數(shù)有13個(gè)(Asp、Glu)，帶正電荷的氨基酸殘基個(gè)數(shù)有25個(gè)(Arg、Lys)，親水性的總平均值為0.618。如圖3結(jié)果所示，OsURGT1蛋白氨基酸組成中，亮氨酸(Leu)的含量最高，其次是纈氨酸(Val)，含量最低的是色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)和天冬氨酸(Asp)，氨基酸含量在5%以上的有9種氨基酸。

2.2.2 OsURGT1蛋白的親/疏水性分析 利用ProtScale工具對(duì)OsURGT1蛋白進(jìn)行親/疏水性分析。如圖4所示，OsURGT1蛋白的氨基酸分布于0以上的閾值大于分布于0以下的閾值，推測(cè)OsURGT1蛋白為疏水性蛋白，疏水性最大值為3.367，位于第139個(gè)氨基酸，最小值為-2.500，位于第306個(gè)氨基酸。

圖2 水稻OsURGT1基因的全長(zhǎng)CDS及對(duì)應(yīng)的氨基酸序列Fig.2 Full-length CDS and deduced amino acid sequence of OsURGT1 gene in Oryza sativa

Val.纈氨酸；Tyr.酪氨酸；Trp.色氨酸；Thr.蘇氨酸；Ser.絲氨酸；Pro.脯氨酸；Phe.苯丙氨酸；Met.甲硫氨酸；Lys.賴氨酸；Leu.亮氨酸；Ile.異亮氨酸；His.組氨酸；Gly.甘氨酸；Glu.谷氨酸；Cys.半胱氨酸；Gln.谷氨酰胺；Asp.天冬氨酸；Asn. 天冬酰胺；Arg.精氨酸；Ala.丙氨酸。

圖4 OsURGT1蛋白的親/疏水性分析Fig.4 Hydrophilici/hydrophobic analysis of OsURGT1 protein

2.2.3 OsURGT1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析 如圖5所示，OsURGT1蛋白有9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其是一個(gè)膜蛋白。

2.2.4 OsURGT1蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)分析 如圖6-A、B所示，OsURGT1蛋白預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋有59個(gè)，占比17.82%；延伸鏈有119個(gè)，占比35.95%；無(wú)規(guī)則卷曲有153個(gè)，占比46.22%。對(duì)OsURGT1蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模預(yù)測(cè)(圖6-C)，結(jié)果顯示，依據(jù)一個(gè)與其匹配度最高的模板蛋白，以100%的置信度對(duì)OsURGT1蛋白的291個(gè)氨基酸(覆蓋率達(dá)88%)進(jìn)行了建模，模板蛋白是一個(gè)膜蛋白，并且是一個(gè)GDP-甘露糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，即NST蛋白。這表明OsURGT1蛋白不但在一級(jí)結(jié)構(gòu)上符合NST的特征，在高級(jí)結(jié)構(gòu)上亦具有NST的特征。

圖5 OsURGT1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of OsURGT1 protein

2.2.5 OsURGT1蛋白的進(jìn)化樹分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過蛋白序列比對(duì)，選取16個(gè)物種中與水稻OsURGT1同源性較高的蛋白，即山茶CsURGT(Camelliasinensis，XP_028106522)、油棕EgURGT(Elaeisguineensis， XP_010906037)、短花藥野生稻ObURGT(Oryzabrachyantha， XP_006647512)、哈氏黍PhURGT(Panicumhallii， XP_025814183)、豬粟PmURGT(Panicummiliaceum，RLM80742)、毛果楊PtURGT(Populustrichocarpa，XP_002307514)、高粱SbURGT(Sorghumbicolor，XP_021310114)、小米SiURGT(Setariaitalica， XP_004953102)、玉米ZmURGT(Zeamays， PWZ39018)、二穗短柄草BdURGT(Brachypodiumdistachyon， XP_003575354)、鐵皮石斛DcURGT(Dendrobiumcatenatum，XP_020688249)、陸地棉GhURGT(Gossypiumhirsutum，XP_016732973)、三裂葉薯ItURGT(Ipomoeatriloba，XP_031117650.)、核桃JeURGT(Juglansregia， XP_018846584)、荷花NnURGT(Nelumbonucifera，XP_010242229)、可可TcURGT(Theobromacacao， XP_007048167)。運(yùn)用Mega 6.06軟件對(duì)這17個(gè)同源性較高的蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，由圖7結(jié)果可知，進(jìn)化樹總共分成了兩大分支，在第一分支上OsURGT1蛋白與短花藥野生稻中的ObURGT親緣關(guān)系最近，而與第二分支上的物種蛋白(可可、山茶、三裂葉薯、荷花、陸地棉、核桃、毛果楊)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

A.OsURGT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同的字母代表不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)(h.α螺旋；e.延伸鏈；c.無(wú)規(guī)則卷曲)；B.OsURGT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)的評(píng)分結(jié)構(gòu)(藍(lán)色.α 螺旋；紫色.無(wú)規(guī)則卷曲；紅色.延伸鏈)；C.OsURGT1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

圖7 OsURGT1相關(guān)蛋白的進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic tree analysis for OsURGT1 related proteins

2.2.6OsURGT1基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析 截取OsURGT1基因起始密碼子ATG前2 000 bp的序列作為基因啟動(dòng)子序列，運(yùn)用在線工具Plant CARE對(duì)OsURGT1基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析(表2)。除部分未知功能順式元件外，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子區(qū)域含有參與激素調(diào)控的順式作用元件，如ABA(脫落酸)、MeJA(茉莉酸鉀酯)、GA(赤霉素)，還有參與光響應(yīng)調(diào)控和脅迫誘導(dǎo)調(diào)控的順式作用元件，從而推測(cè)OsURGT1基因可能參與部分激素調(diào)控與逆境脅迫響應(yīng)。

2.3 水稻OsURGT1基因的表達(dá)譜分析

2.3.1 組織表達(dá)譜 取三葉期水稻幼苗的根和葉，孕穗期水稻的根、莖、葉、穗、葉鞘分別進(jìn)行OsURGT1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析。從圖8可以看出，在三葉期時(shí)，OsURGT1基因在葉中的表達(dá)量顯著高于根中表達(dá)量。孕穗期時(shí)，在葉中的表達(dá)量最高，其次是葉鞘，表達(dá)量最低的是根。從以上結(jié)果可知，OsURGT1基因在植株的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期都有表達(dá)，說明該基因參與水稻植株的生長(zhǎng)發(fā)育過程。

表2 OsURGT1基因的啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件Tab.2 Cis-acting elements prediction for the promoter sequence of OsURGT1 gene

YR.三葉期的根；YL.三葉期的葉；R.孕穗期的根；S.孕穗期的莖；L.孕穗期的葉；LS.孕穗期的葉鞘；SP.穗。柱形圖上方的不同小寫字母表示OsURGT1基因在不同組織中表達(dá)量的顯著性差異(P<0.05)。圖9-10同。

2.3.2 激素誘導(dǎo)表達(dá)譜 為了解水稻OsURGT1基因是否參與激素調(diào)控途徑，將三葉期水稻幼苗用6種激素處理，分別是ABA(脫落酸)、GA(赤霉素)、SA(水楊酸)、Eth(乙烯)、2，4-D(植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑)、MeJA(茉莉酸鉀酯)，在處理不同時(shí)間段后(0，1，3，6，12，24 h)分別取地上部分組織樣品，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行OsURGT1基因表達(dá)量檢測(cè)。從圖9可知，在2，4-D處理后，OsURGT1基因表達(dá)量在處理1 h后急劇上升，之后一直保持在一個(gè)相對(duì)較高的水平；在ABA處理后，OsURGT1基因的表達(dá)量總體呈現(xiàn)一個(gè)波動(dòng)上升的過程，在0～3 h逐漸上升，6 h下降，之后逐漸緩慢上升，在處理24 h達(dá)到最大值；在Eth處理后，OsURGT1基因的表達(dá)量在處理1 h急劇上升，3 h下降之后呈逐漸上升趨勢(shì)，在處理24 h表達(dá)量達(dá)最大值；在SA和GA處理后，OsURGT1基因表達(dá)量總體呈上升趨勢(shì)，但前期上升相對(duì)緩慢，在處理12～24 h過程中上升幅度較大；而在MeJA處理后，OsURGT1基因的表達(dá)量在處理1 h降低，但在3 h顯著升高后快速降低至0 h水平，之后又持續(xù)升高。經(jīng)過表達(dá)量的差異顯著性分析結(jié)果可看出，經(jīng)2，4-D、ABA、Eth激素處理后OsURGT1基因在處理1～24 h的表達(dá)量與在處理0 h的表達(dá)量差異顯著；經(jīng)GA和SA處理后OsURGT1基因在處理3～24 h的表達(dá)量與在處理0～1 h的表達(dá)量差異顯著；經(jīng)MeJA處理后OsURGT1基因在處理1，3，12，24 h的表達(dá)量與在處理0，6 h的表達(dá)量差異顯著。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，OsURGT1基因可能直接或間接參與了ABA、GA、SA、Eth、2，4-D、MeJA這幾種激素的相關(guān)調(diào)控過程。

圖9 水稻OsURGT1基因的激素處理誘導(dǎo)表達(dá)譜分析Fig.9 The induced expression profile analysis of gene OsURGT1 after treated by hormones

2.3.3 非生物脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)譜 為了解水稻OsURGT1基因是否參與多種非生物脅迫的功能調(diào)控，將三葉期水稻幼苗分別用6種非生物脅迫處理，分別是PEG4000(干旱)、H2O2(氧化)、42 ℃(高溫)、4 ℃(低溫)、NaCl(鹽)、CdCl2(鎘)，在處理不同時(shí)間段后(0，1，3，6，12，24 h)分別取地上部分組織樣品，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行OsURGT1基因的表達(dá)量檢測(cè)。從圖10可知，OsURGT1基因在42 ℃高溫條件處理下，表達(dá)量在處理1 h急劇上升，又在處理3 h急劇降低至比處理0 h還低的水平，之后再緩慢上升至第2高的表達(dá)水平；在CdCl2條件處理下，OsURGT1基因的表達(dá)量在處理1 h顯著升高，3 h急劇降低后又緩慢上升至0 h水平，24 h時(shí)又顯著降低；在4 ℃低溫條件處理下，OsURGT1基因的表達(dá)量先緩慢上升，在處理6 h急劇上升至相對(duì)最大值，之后有一定程度的降低，在處理1～24 h的表達(dá)量均比0 h的表達(dá)量高；在PEG4000干旱條件處理下，OsURGT1基因的表達(dá)量在1 h上升，之后呈現(xiàn)一個(gè)波動(dòng)下降的趨勢(shì)，且在處理3～24 h表達(dá)量均顯著低于0 h；在NaCl鹽條件處理下，OsURGT1基因的表達(dá)量在處理1 h達(dá)到最大值，之后急劇下降，在處理6 h達(dá)到最小值，之后有一定程度的上升； 在H2O2條件處理下，OsURGT1基因的表達(dá)量總體呈現(xiàn)一個(gè)波動(dòng)下降的趨勢(shì)，在1 h降低，3 h升高，6 h降低，12 h有所升高，之后又降低。通過表達(dá)量的差異顯著性分析結(jié)果可看出，經(jīng)高溫、鎘、低溫、干旱、鹽處理后，OsURGT1基因的表達(dá)量在處理0～24 h的整個(gè)過程中的變化差異較顯著；經(jīng)氧化處理后，OsURGT1基因的表達(dá)量在處理0，3 h、1，12 h、6，24 h 3組的組內(nèi)兩兩之間無(wú)顯著性差異，3組的相互之間存在顯著性差異，但是從處理的整個(gè)過程看表達(dá)量變化幅度不大。根據(jù)以上結(jié)果可知，OsURGT1基因?qū)Ω珊?、氧化、高溫、低溫、鹽、重金屬鎘這些逆境脅迫都有不同程度的響應(yīng)，說明OsURGT1基因極有可能在水稻中參與了這些逆境脅迫的功能調(diào)控過程。

圖10 非生物脅迫處理后OsURGT1基因的誘導(dǎo)表達(dá)譜分析Fig.10 The inducted expression profile analysis of gene OsURGT1 after treated by abiotic stresses

3 討論

植物生長(zhǎng)發(fā)育需要各種糖基化合物，包括各類多糖、糖蛋白、蛋白多糖、糖脂和其他一些次生代謝產(chǎn)物等。核苷酸單糖則是形成這些糖基化合物的基礎(chǔ)小分子化合物[24]。大多數(shù)核苷酸單糖在細(xì)胞質(zhì)溶膠中產(chǎn)生后，由高爾基體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的NSTs蛋白將這些核苷酸單糖反向轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，再經(jīng)高爾基體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的糖基轉(zhuǎn)移酶(GTs)將各種各樣的UDP-或GDP-糖殘基用于各種多糖分子的生物合成[25-26]，因此，NSTs蛋白大多都定位于高爾基體[15-17]，部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[20]，或者同時(shí)定位于高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[14，19]。除此之外，NSTs蛋白還具有一些相似的特點(diǎn)，如一般由300～400個(gè)氨基酸組成，擁有6～10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，催化位點(diǎn)面向細(xì)胞器的內(nèi)腔，一般為疏水性蛋白等[27-29]。本研究利用擬南芥AtURGT基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，獲得了水稻OsURGT1基因，其全長(zhǎng)為3 421 bp，CDS全長(zhǎng)為996 bp，含有5個(gè)外顯子，編碼331個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的蛋白質(zhì)；預(yù)測(cè)結(jié)果表明，OsURGT1蛋白含有9個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是一個(gè)膜蛋白；蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，OsURGT1蛋白為疏水性蛋白；蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模結(jié)果顯示，OsURGT1蛋白與一個(gè)NST蛋白模板高度相似，88%的氨基酸殘基建模置信度達(dá)到100%。以上結(jié)果皆表明，OsURGT1基因編碼蛋白的序列及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)符合NST家族蛋白的特點(diǎn)，OsURGT1蛋白極有可能在水稻中發(fā)揮NST蛋白功能，至于其具體轉(zhuǎn)運(yùn)哪種類型的核苷酸單糖，有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果顯示，OsURGT1基因在水稻苗期及孕穗期的各個(gè)組織中都有表達(dá)，在葉和莖中的表達(dá)量相對(duì)較高，在根和穗中表達(dá)量相對(duì)較低，尤其是在根中的表達(dá)量相對(duì)最低，說明OsURGT1基因在水稻的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程中應(yīng)該發(fā)揮一定的作用，且在葉的生長(zhǎng)發(fā)育過程中可能發(fā)揮相對(duì)更重要的作用。

通過對(duì)OsURGT1基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)OsURGT1基因的啟動(dòng)子區(qū)域含有參與激素調(diào)控(ABA-脫落酸、MeJA-茉莉酸鉀酯、GA-赤霉素)、光響應(yīng)和脅迫誘導(dǎo)調(diào)控(低溫誘導(dǎo)和厭氧)的順式作用元件；不同激素及非生物脅迫處理響應(yīng)表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果表明，OsURGT1基因?qū)τ诟鞣N激素(ABA-脫落酸、GA-赤霉素、SA-水楊酸、Eth-乙烯、2，4-D-植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、MeJA-茉莉酸鉀酯)處理皆有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的變化；對(duì)于非生物脅迫處理中的高低溫、PEG4000、CdCl2、NaCl也有一定程度的響應(yīng)表達(dá)。綜上，OsURGT1基因極有可能參與水稻以上相關(guān)調(diào)控途徑，但其具體的調(diào)控功能及機(jī)理有待進(jìn)一步深入探索。