劉 東，蘭艷平，張 麗，趙 巖，渠云芳，黃晉玲

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育是高等植物中不能產(chǎn)生有功能花粉的一種母性遺傳性狀，是雄蕊退化、花粉敗育或功能不育等原因造成的雄蕊不能正常授粉而雌蕊功能正常的現(xiàn)象。利用雄性不育系育種是作物雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。

Capitani等[1]研究發(fā)現(xiàn)，植株的雄性不育系花藥在發(fā)育過程中，有氧呼吸途徑相關(guān)酶的活性普遍降低，認(rèn)為植物雄性不育花藥敗育過程與能量代謝異常密切相關(guān)。關(guān)于能量代謝異常導(dǎo)致作物雄性不育在玉米、水稻、小麥等作物上均有研究報道。大量研究已表明，植物雄性不育的發(fā)生與植物體內(nèi)能量的代謝異常有一定的相關(guān)性[2-4]。

在生物體的正常代謝過程中，線粒體通過呼吸作用，為植物體的正常發(fā)育提供能量。研究表明，在雄性不育花藥中以呼吸底物降解的糖酵解-三羧酸循環(huán)(TCA)途徑為主[5]。線粒體中的糖經(jīng)過糖酵解途徑形成丙酮酸，丙酮酸再轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行能量代謝，丙酮酸脫氫酶起到關(guān)鍵作用，其可以將丙酮酸脫羧氧化成乙酰輔酶A，進(jìn)而影響三羧酸循環(huán)。丙酮酸脫氫酶磷酸酶(Pyruvate dehydrogenase phosphatase，PDP)屬于蛋白磷酸酶M家族(Protein phosphatase M，PPM)，是位于線粒體上的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，是丙酮酸脫氫酶活性的正調(diào)控因子，在線粒體中通過水解PDC-E1α亞基絲氨酸上的磷酸基團(tuán)而恢復(fù)PDC活性，以保證代謝的正常進(jìn)行。通過對棉花雄性不育系的丙酮酸脫氫酶磷酸酶的研究，可以揭示CMS機(jī)制，為更好地利用雜種優(yōu)勢提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)踐意義。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花育種實(shí)驗(yàn)室前期已從棉花晉A不育系中克隆出GhPDP基因，并成功將其構(gòu)建到pMD-19T載體上[6]。本研究以pMD-19T-GhPDP質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增GhPDP基因的cDNA編碼區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-22b-GhPDP，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，并對表達(dá)條件進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化，以提高GhPDP可溶性表達(dá)量，為進(jìn)一步研究GhPDP在棉花雄性不育過程中能量調(diào)控方面的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌Trans1-T1、Transetta(DE3)均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；原核表達(dá)載體pET-22b、pMD-19T-GhPDP重組質(zhì)粒均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花育種實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由蘇州金唯智公司合成；甘氨酸、SDS、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED購自美國Amresco公司；2×Pfu PCR MasterMix購自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeSTAR GXL DNA Polymerase購自TaKaRa公司；Tris購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 通過Over-lap PCR將目的基因GhPDP連接到pET-22b載體上，引物序列列于表1。使用PDP-F1/R1和PDP-F2/R2分別擴(kuò)增基因和載體，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收；將回收的基因片段和載體片段按摩爾比1∶1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其結(jié)果。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 PCR primer sequences

將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆送至蘇州金唯智公司進(jìn)行測序，并提取其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta(DE3)。

1.2.2 GhPDP蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化 為獲得較多可溶性目的蛋白，設(shè)計單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對目的蛋白進(jìn)行優(yōu)化表達(dá)，并采用Bradford方法[7]進(jìn)行蛋白定量，即不同誘導(dǎo)溫度、時間、IPTG終濃度和菌體密度OD600對目的蛋白表達(dá)量的影響。

1.2.2.1 誘導(dǎo)溫度 將轉(zhuǎn)化菌株接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，第2天轉(zhuǎn)接至新的培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.8時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，分別在16，20，24 ℃誘導(dǎo)5 h后離心收集菌體，超聲波破碎菌體，收集上清與沉淀，加入4×蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min，離心后經(jīng)13% SDS-PAGE鑒定。

1.2.2.2 誘導(dǎo)時間 細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.2.2.1，培養(yǎng)至OD600為0.8時加入IPTG至終濃度為0.1 mmol/L，在20 ℃分別培養(yǎng)3，5，7，10 h后收集菌體，超聲波破碎菌體，收集上清與沉淀，經(jīng)13% SDS-PAGE電泳。

1.2.2.3 IPTG終濃度 細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.2.2.1，培養(yǎng)至OD600為0.8，分別加入終濃度為0.05，0.10，0.15 mmol/L的IPTG，在20 ℃誘導(dǎo)5 h后收集菌體，超聲波破碎菌體，收集上清與沉淀，經(jīng)13% SDS-PAGE電泳。

1.2.2.4 菌體密度OD600細(xì)菌培養(yǎng)方法同1.2.2.1，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600分別為0.5，0.8，1.0時，加入IPTG至終濃度為0.10 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)5 h，菌體經(jīng)超聲波破碎、離心，收集上清與沉淀，經(jīng)13% SDS-PAGE電泳。

1.2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平的正交試驗(yàn)，具體組合列于表2。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計Tab.2 Orthogonal experiment design

1.2.2.6 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 按照已設(shè)計的正交試驗(yàn)進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)13% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)果經(jīng)GeneTools凝膠分析軟件進(jìn)行目的蛋白定量，得出最佳誘導(dǎo)條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定

GhPDP基因與pET-22b載體擴(kuò)增后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增的基因片段和載體片段大小分別約為1 152，5 493 bp，與預(yù)期的理論大小相符，沒有非特異擴(kuò)增存在。將2個片段切膠回收按摩爾比1∶1進(jìn)行GhPDP基因與pET-22b載體的連接，結(jié)果如圖2所示，重組表達(dá)載體以多聚體的形式產(chǎn)生，同時因分子量過大而積存于瓊脂糖凝膠的上樣孔中。將多聚體通過熱激轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果擴(kuò)增出與理論基因大小相符合的片段(圖3)。將陽性克隆測序，通過DNAMAN序列比對結(jié)果正確，表明pET-22b-GhPDP重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M. Trans2K Plus DNA Marker；1. pET-22b載體 的擴(kuò)增結(jié)果；2. GhPDP基因的擴(kuò)增結(jié)果。 M. Trans2K Plus DNA Marker; 1. Amplification results of pET-22b vector; 2. Amplification results of GhPDP gene.

M. Trans2K Plus DNA Marker；1. 多聚體。 M. Trans2K Plus DNA Marker; 1. Multimer.

M. Trans2K Plus DNA Marker；1. PCR驗(yàn)證結(jié)果。 M. Trans2K Plus DNA Marker; 1. PCR verification results.

2.2 目的蛋白表達(dá)形式的確定

將含重組質(zhì)粒pET-22b-GhPDP的Transetta(DE3)接種在具有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)以及13%的SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，與空載轉(zhuǎn)化菌相比，在48 ku處有一條特異的蛋白表達(dá)條帶，分子量與預(yù)期目的蛋白大小相當(dāng)，表明目的蛋白在Transetta(DE3)中表達(dá)，其中，大部分以包涵體的形式存在于沉淀中，很少一部分形成可溶性蛋白(圖4)。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.空載表達(dá)后的上清；2.重組蛋白在Transetta(DE3)中表達(dá)后的上清；3.空載表達(dá)后的沉淀；4.重組蛋白在Transetta(DE3)中表達(dá)后的沉淀。

2.3 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

2.3.1 不同誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)量的影響 在OD600為0.8，IPTG終濃度為0.10 mmol/L以及誘導(dǎo)溫度分別為16，20，24 ℃條件下，誘導(dǎo)5 h離心收集菌體進(jìn)行超聲波破碎，獲得上清與沉淀，經(jīng)13%的SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，可溶性目的蛋白的表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢；在誘導(dǎo)溫度為20 ℃的條件下，GhPDP蛋白的可溶性表達(dá)量最高(圖5)，通過GeneTools凝膠分析軟件測定，其占上清總蛋白含量的6.98%。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. pET-22b-GhPDP未誘導(dǎo)；2-4. 16，20，24 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)5 h后的上清；5-7. 16，20，24 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)5 h后的沉淀。

2.3.2 不同誘導(dǎo)時間對目的蛋白表達(dá)量的影響 在OD600為0.8、誘導(dǎo)溫度為20 ℃、IPTG終濃度為0.10 mmol/L條件下，分別誘導(dǎo)3，5，7，10 h進(jìn)行超聲波破碎，經(jīng)13% SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，誘導(dǎo)5 h時，目的蛋白可溶性表達(dá)量最高(圖6)，其占上清總蛋白含量的6.65%。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-22b-GhPDP未誘導(dǎo)；2-5. 20 ℃條件下IPTG的誘導(dǎo)3，5，7，10 h后的上清；6-9. 20 ℃條件下IPTG分別誘導(dǎo)3，5，7，10 h后的沉淀。

2.3.3 不同IPTG終濃度對目的蛋白表達(dá)量的影響 在OD600為0.8、誘導(dǎo)溫度為20 ℃條件下，分別加入IPTG至終濃度為0.05，0.10，0.15 mmol/L，誘導(dǎo)5 h，離心收集菌體沉淀進(jìn)行超聲波破碎，取上清與沉淀進(jìn)行13%的SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖7所示，在IPTG終濃度為0.10 mmol/L時，可溶性目的蛋白表達(dá)量最高，其占上清總蛋白含量的7.30%。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. pET-22b-GhPDP未誘導(dǎo)；2-4. 20 ℃條件下終濃度分別為0.05，0.10，0.15 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h后的上清；5-7. 20 ℃條件下終濃度分別為0.05，0.10，0.15 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h后的沉淀。

2.3.4 不同菌體密度OD600對目的蛋白表達(dá)量的影響 分別在菌體密度OD600為0.5，0.8，1.0時，加入0.10 mmol/L的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)5 h，取上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示，隨著菌體密度逐漸增加，可溶性目的蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(圖8)；當(dāng)OD600達(dá)到0.8時，IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生的可溶性目的蛋白含量最多，其占上清總蛋白含量的8.65%。

綜合以上單因素試驗(yàn)可知，可溶性目的蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件為：在20 ℃條件下，當(dāng)菌體密度OD600達(dá)到0.8時，加入終濃度0.10 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h。在此誘導(dǎo)條件下，可溶性目的蛋白表達(dá)量最高。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1. pET-22b-GhPDP未誘導(dǎo)；2-4. 分別在OD600為0.5，0.8，1.0開始誘導(dǎo)5 h后的上清；5-7. 分別在OD600為0.5，0.8，1.0開始誘導(dǎo)5 h后的沉淀。

2.3.5 GhPDP蛋白誘導(dǎo)優(yōu)化條件正交試驗(yàn) 按照已設(shè)計的正交試驗(yàn)(表2)進(jìn)行目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)13% SDS-PAGE電泳(圖9)，可以清晰地看出，GhPDP基因在不同條件下的表達(dá)量有明顯的差異。在上清的SDS-PAGE結(jié)果中發(fā)現(xiàn)泳道5的目的蛋白表達(dá)量最高。

2.3.6 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 通過GeneTools凝膠分析軟件定量可溶性目的蛋白濃度，對各因素數(shù)據(jù)進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表3所示，各因素極差大小分別為3.44，2.76，3.21，1.73，通過R值確定誘導(dǎo)條件的各因素影響主次為誘導(dǎo)溫度>IPTG終濃度>誘導(dǎo)時間>OD600，正交試驗(yàn)最佳組合是，誘導(dǎo)溫度為20 ℃、誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.15 mmol/L、誘導(dǎo)時間為5 h、菌體密度OD600為0.5，在此誘導(dǎo)條件下，可溶性目的蛋白表達(dá)量最大，達(dá)到8.96%。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，按正交設(shè)計優(yōu)化的最佳條件重復(fù)進(jìn)行了3次誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，目的蛋白表達(dá)量均穩(wěn)定地占上清總蛋白含量的8.96%左右。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn); 1-9. 對應(yīng)表3各正交試驗(yàn)組的上清; 10-18. 對應(yīng)表3各正交試驗(yàn)組的沉淀。 M. Protein molecular weight standard; 1-9. Corresponding to the supernatant of each orthogonal experimental group of Tab.3; 10-18. Corresponding to the precipitation of each orthogonal experimental group of Tab.3.

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計及其結(jié)果Tab.3 Design table and results of orthogonal test

3 結(jié)論與討論

植物雄性不育的研究是雜種優(yōu)勢利用理論研究的重要內(nèi)容，大量研究證明，能量代謝失衡與植物雄性不育存在一定關(guān)系[1]，而線粒體是為機(jī)體提供能量的動力工廠。細(xì)胞存亡與物質(zhì)能量代謝調(diào)節(jié)契合于丙酮酸，糖類經(jīng)過初步酵解后形成丙酮酸，丙酮酸被運(yùn)輸?shù)骄€粒體內(nèi)經(jīng)過氧化脫羧形成乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)(TCA)，最后經(jīng)過氧化磷酸化形成大量的ATP。線粒體丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(mtPDC)調(diào)控丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)并且催化的反應(yīng)不可逆，2種調(diào)節(jié)酶PDK/PDP通過對PDC-E1a亞基的磷酸化和去磷酸化使PDC失活或復(fù)活，PDP作為PDC的調(diào)控酶，對能量代謝具有極其重要的作用。

3.1 GhPDP原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)

許多外源蛋白表達(dá)主要以無活性、不溶性的包涵體形式產(chǎn)生[8]。其中，包涵體的形成原因很多，外源基因的快速高效表達(dá)是其中的原因之一[9]。外源基因在大腸桿菌中能否高效表達(dá)受很多因素影響，如大腸桿菌菌株、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑IPTG的終濃度和誘導(dǎo)時間[10]。潘濱等[11]在大腸桿菌Rosetta(DE3)、BL21(DE3) pLysS和Rs21菌株誘導(dǎo)Rep蛋白表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用表達(dá)菌株BL21(DE3) pLysS和Rs21菌株時，Rep蛋白表達(dá)量很低；當(dāng)選用表達(dá)菌株Rosetta(DE3)時，Rep蛋白表達(dá)明顯，且在IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)量顯著增加。

本試驗(yàn)采用目前廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白棉花丙酮酸脫氫酶磷酸酶GhPDP，選用表達(dá)載體為pET-22b，其能夠編碼6個組氨酸殘基、并與目的蛋白的C末端形成融合蛋白，可以直接用于后續(xù)目的蛋白的純化[12-14]，且由于組氨酸標(biāo)簽非常小，對目的蛋白的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)造成影響較小，因此，不需要將其從目的蛋白中切除；pET-22b表達(dá)載體上的T7啟動子在加入誘導(dǎo)劑IPTG時能與大腸桿菌Transetta(DE3)菌株內(nèi)的T7 RNA聚合酶特異性結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)下游靶基因的表達(dá)。本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET-22b-GhPDP重組表達(dá)載體，并在大腸桿菌Transetta(DE3)內(nèi)表達(dá)，表達(dá)形式多為包涵體，少量為可溶性蛋白。

3.2 誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)量的影響

誘導(dǎo)溫度是影響原核蛋白表達(dá)的重要因素之一[15]。高溫誘導(dǎo)時，大腸桿菌的生長速度快，表達(dá)蛋白的速度也隨之加快，導(dǎo)致表達(dá)的目的蛋白沒有足夠的時間進(jìn)行正確的折疊，從而容易形成包涵體。因此，降低溫度有利于目的蛋白的可溶性表達(dá)。本試驗(yàn)中，目的蛋白在16，20，24 ℃表達(dá)時均有包涵體形成，但在20 ℃時目的蛋白可溶性表達(dá)量最高。

3.3 IPTG濃度對目的蛋白表達(dá)量的影響

IPTG終濃度對大腸桿菌生長和蛋白表達(dá)也有一定的影響[16]，IPTG 是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導(dǎo)劑，合理的濃度可提高表達(dá)量，在縮短表達(dá)周期的同時可降低成本；而濃度過高會增加原核表達(dá)系統(tǒng)的負(fù)載，抑制細(xì)菌的生長，甚至對細(xì)胞具有一定的殺傷作用[17]。因此，本試驗(yàn)采用低終濃度的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，當(dāng)IPTG終濃度為0.10 mmol/L時，誘導(dǎo)的可溶性目的蛋白相對較多。

3.4 誘導(dǎo)時間對目的蛋白表達(dá)量的影響

不同的蛋白誘導(dǎo)時間也不同，有些蛋白對細(xì)胞有毒害作用[18-20]。因此，需要對誘導(dǎo)時間進(jìn)行優(yōu)化。在本試驗(yàn)中，隨著誘導(dǎo)時間的增加，目的蛋白的可溶性表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢；在5 h時可溶性蛋白表達(dá)相對較多，5 h后達(dá)重組菌的生長平衡期，此時融合蛋白的表達(dá)量已無明顯增加；若繼續(xù)培養(yǎng)可則能會由于菌體老化分解導(dǎo)致表達(dá)量反而下降。

3.5 菌體密度OD600對目的蛋白表達(dá)量的影響

原核表達(dá)中誘導(dǎo)時機(jī)也很重要，誘導(dǎo)時機(jī)過早會導(dǎo)致目的蛋白產(chǎn)量降低；而誘導(dǎo)時機(jī)過晚會影響工程菌的穩(wěn)定性和活性，進(jìn)而影響目的蛋白的表達(dá)量。在本試驗(yàn)中，隨著菌體密度逐漸增加，可溶性目的蛋白的量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在菌體密度OD600為0.8時，可溶性目的蛋白相對較多，重組菌進(jìn)入對數(shù)生長期初期，重組質(zhì)?？截悢?shù)大量擴(kuò)增，細(xì)菌濃度較低，加入 IPTG 誘導(dǎo)后外源營養(yǎng)物質(zhì)將主要用于融合蛋白表達(dá)，而外源蛋白合成將和細(xì)菌自身的生長繁殖競爭營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制重組菌的生長。

3.6 原核表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件

正交試驗(yàn)充分考慮交互作用和全面性，選取部分具有代表性的試驗(yàn)點(diǎn)，對試驗(yàn)因素及條件進(jìn)行優(yōu)化組合，從而使試驗(yàn)效率提高[21]。本試驗(yàn)通過對誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時間、IPTG終濃度和菌體濃度OD600進(jìn)行正交試驗(yàn)，對其結(jié)果分析得出，誘導(dǎo)條件的各因素影響主次為誘導(dǎo)溫度>IPTG終濃度>誘導(dǎo)時間>OD600；綜合所有因素得出誘導(dǎo)最佳條件：菌體密度OD600為0.8、誘導(dǎo)溫度為20 ℃、IPTG終濃度為0.10 mmol/L、誘導(dǎo)時間為5 h，此條件下，可溶性目的蛋白可達(dá)8.96%。