蔣景龍，李 麗

(1. 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2. 陜西理工大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001)

土壤鹽漬化是嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性的問題，直接影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量[1-2]。黃瓜(CucumissativusL.)作為主要的設(shè)施蔬菜之一，其對鹽脅迫抗性較弱，發(fā)芽期和幼苗期對鹽脅迫尤其敏感，鹽會導(dǎo)致其產(chǎn)生滲透脅迫和離子毒害，引起養(yǎng)分虧缺、氧化脅迫、光合作用抑制及關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)變化、生物膜的正常結(jié)構(gòu)和功能變化等一系列次生脅迫[3-5]，最終抑制其種子萌發(fā)及植株生長。研究黃瓜耐鹽機(jī)制對提高農(nóng)作物的耐鹽性具有重要的參考價(jià)值。

硫化氫(H2S)是一種植物內(nèi)源性氣體信號分子，其與植物激素及信號分子相互作用，在植物生長發(fā)育的調(diào)控及非生物脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[6]。信號分子H2S對植物鹽脅迫的傷害具有緩解作用，在抵御植物鹽害中發(fā)揮著重要作用[7-9]。外源H2S能有效緩解加工番茄種子萌發(fā)過程中鹽脅迫的抑制作用，促進(jìn)種子的萌發(fā)[10]。外源H2S能夠通過提高鹽脅迫下茶樹和水稻的抗氧化水平來降低活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的積累，減輕膜脂過氧化程度，從而緩解鹽脅迫引起的氧化損傷[11-12]。外源H2S可能與一氧化氮(Nitric oxide，NO)相互作用減少氧化損傷來增強(qiáng)苜蓿種子萌發(fā)過程中抵御鹽脅迫的能力[13]。外源H2S和過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)協(xié)同作用可以誘導(dǎo)增強(qiáng)NaCl脅迫下加工番茄幼苗植株滲透調(diào)節(jié)能力、提高清除ROS的酶促系統(tǒng)的防御能力，從而減弱加工番茄細(xì)胞內(nèi)ROS自由基對質(zhì)膜的傷害，進(jìn)而提高加工番茄幼苗對鹽脅迫的適應(yīng)[14]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)外源H2S能夠通過提高黃瓜光合作用和蒸騰作用，有效改善光系統(tǒng)Ⅱ參數(shù)和氣孔參數(shù)；增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，降低活性氧的積累和膜質(zhì)過氧化作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Na+和K+的平衡穩(wěn)定狀態(tài)，從而有效緩解鹽脅迫對黃瓜幼苗造成的生長抑制[15]；然后利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究了外源H2S對高鹽脅迫下黃瓜葉片蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白的分子功能主要以蛋白質(zhì)結(jié)合和水解酶活性為主，生物學(xué)過程主要以應(yīng)激反應(yīng)、有機(jī)物代謝、脅迫響應(yīng)和細(xì)胞分化過程等為主[16]。根系是澆灌脅迫作物最先感受逆境脅迫的器官，當(dāng)根區(qū)受到脅迫時(shí)，根系首先感受到并發(fā)出信號。因此，本研究以春夏秋王黃瓜根系為試材，用NaCl、NaCl+H2S處理，采用高通量測序技術(shù)對其根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序分析，以期探討外源H2S調(diào)控黃瓜幼苗響應(yīng)鹽脅迫的機(jī)理，為H2S調(diào)控植物代謝，緩解高鹽逆境障礙提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和處理

試驗(yàn)材料選用春夏秋王黃瓜種子(山東省寧陽縣魯明種子有限公司)，處理方法參考蔣景龍等[17]，待所有幼苗第1片真葉完全展開時(shí)，選取長勢一致的幼苗分成3組，每組8個(gè)平行對照，分別用Hoagland營養(yǎng)液(CK)、200 mmol/L NaCl(T)和200 mmol/L NaCl+15 μmol/L NaHS(S)澆灌處理7 d。選取根系用液氮速凍，轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2 黃瓜根系總RNA提取及文庫構(gòu)建

黃瓜根系總RNA提取方法參照TRIzol Reagent方法進(jìn)行。采用RNA專用瓊脂糖電泳檢測RNA的濃度和純度。通過Oligo(dT)磁珠富集總RNA中帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA，采用離子打斷將RNA打斷到200～300 bp。文庫構(gòu)建完成后，采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段富集，文庫大小在300～400 bp。通過Agilent 2100 Bioanalyzer檢測文庫大小，熒光定量檢測文庫總濃度。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序及分析

由上海派森諾公司完成測序，測序平臺為Illumina HiSeq。樣品上機(jī)測序獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)進(jìn)一步過濾，去除一些帶接頭、低質(zhì)量的序列從而獲得高質(zhì)量序列。比對參考基因、基因表達(dá)差異分析、GO富集分析和KEGG富集分析參考文獻(xiàn)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始數(shù)據(jù)整理

如表1 所示，9個(gè)樣本cDNA測序共獲得原始序列365.35 Mb，原始序列經(jīng)質(zhì)控過濾后得到高質(zhì)量序列 360.63 Mb，高質(zhì)量序列堿基數(shù)共53.05 Gb，比對上參考基因組的序列總數(shù)為315.74 Mb，比例為86.27%～88.64%。Q30在87.65%以上，表明測序結(jié)果可靠，可用于后續(xù)的分析。

2.2 基因表達(dá)差異分析

通過DESeq對3組的差異表達(dá)基因分析結(jié)果用火山圖(圖1)展示。圖中越靠近左邊或右邊的點(diǎn)表達(dá)差異越顯著。結(jié)果顯示，CK-T比較組共2 244個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因有1 168個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有1 076個(gè)；T-S比較組共653個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因有435個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有218個(gè)；CK-S比較組共1 696個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因有757個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有939個(gè)。

表1 數(shù)據(jù)過濾和RNA-Seq Map統(tǒng)計(jì)Tab.1 Data filtering and statistics of RNA-Seq Map

圖1 黃瓜根系差異表達(dá)基因的火山圖分析Fig.1 Volcano gram analysis of differentially expressed genes in cucumber roots

將3個(gè)組差異表達(dá)基因繪制維恩圖，尋找特有的和共有的差異表達(dá)基因。如圖2所示，3個(gè)比較組一共有3 073個(gè)差異表達(dá)基因，其中CK-T、T-S和CK-S比較組特有的差異表達(dá)基因數(shù)分別為836，415，331個(gè)，共有的差異表達(dá)基因有29個(gè)，CK-T和T-S組共有的差異表達(dá)基因有155個(gè)。CK-T、T-S組共有的差異表達(dá)基因極有可能與H2S調(diào)控黃瓜響應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)制有關(guān)。篩選CK-T和T-S比較組共有差異表達(dá)基因中差異最顯著的10個(gè)基因，由表2可見，在CK-T比較組中除了Csa_1G303700上調(diào)，其他均為下調(diào)，而在T-S比較組中均為上調(diào)。

圖2 黃瓜根系差異表達(dá)基因的維恩圖Fig.2 Venn diagram of differentially expressed genes in cucumber roots

表2 CK-T和T-S組共有差異表達(dá)基因中Top10基因Tab.2 CK-T and T-S groups share the 10 most significant differentially expressed genes

2.3 差異表達(dá)基因GO富集分析

對篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析，可分為生物過程、細(xì)胞組分和分子功能3個(gè)一級分類，每一類又分別進(jìn)一步劃分為1 117，155和409個(gè)二級分類。圖3展示了3個(gè)比較組差異表達(dá)基因GO富集程度最高的前20個(gè)分類。差異表達(dá)基因在3個(gè)一級分類中均有分布，主要富集在分子功能類中的結(jié)合(Binding)和催化活性(Catalytic activity)類，生物過程類中的代謝過程(Metabolic process)、細(xì)胞過程(Cellular process)和單一生物過程(Single-organism process)類及細(xì)胞組分類中的膜(Membrane)和膜組分(Membrane part)類中。表2統(tǒng)計(jì)了CK-T和T-S比較組共有差異表達(dá)基因中差異最顯著的10個(gè)基因富集的功能類；Csa_6G525220、Csa_5G585990、Csa_1G303700都富集在細(xì)胞組分類中的膜(Membrane)和膜的組成部分(Integral component of membrane)類。

2.4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析

對差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析(表3)。差異表達(dá)基因共歸為4大類，CK-T比較組的2 244個(gè)差異表達(dá)基因歸為20個(gè)亞類、139個(gè)代謝通路，T-S比較組的653個(gè)差異表達(dá)基因歸為16個(gè)亞類、75個(gè)代謝通路，CK-S比較組的1 696個(gè)差異表達(dá)基因歸為20個(gè)亞類、127個(gè)代謝通路。

圖3 黃瓜根系差異表達(dá)基因GO富集分析柱狀圖Fig.3 Histogram of GO enrichment analysis of differentially expressed genes in cucumber roots

對KEGG富集分析中排名前20的代謝通路做散點(diǎn)圖。由圖4-5可見，CK-T比較組的差異表達(dá)基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、碳代謝(Carbon metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism)、苯丙烷生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)、氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)、細(xì)胞周期(Cell cycle)、氨基糖和核苷酸糖代謝(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)通路中；T-S比較組的差異表達(dá)基因主要集中在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Plant hormone signal transduction)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)和光合作用(Photosynthesis)通路中。經(jīng)基因的相似性比對和同源性分析，從不同處理的黃瓜根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中發(fā)掘出與NaCl和H2S處理相關(guān)的基因，如表2所示，CK-T和T-S比較組差異表達(dá)基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣滲透應(yīng)力門控陽離子通道、氮代謝、α-亞麻酸代謝、茉莉單酰-L-氨基酸水解酶和鉀通道代謝通路。

表3 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Tab.3 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

顏色表示顯著性P值的大小，P值越小顏色越接近紅色；每個(gè)通路下包含的差異基因的多少用點(diǎn)的大小來表示。圖5同。 The size of P-value is represented by the color of dots, the smaller the P-value, the closer the color is to red; The number of differential genes contained in each pathway is represented by the size of dots. The same as Fig.5.

圖5 T-S組差異表達(dá)基因KEGG富集分析散點(diǎn)圖Fig.5 KEGG pathways enrichment analysis of differentially expressed genes of group T-S

3 討論

鹽度是一種多組分非生物脅迫，鹽度過高通常會導(dǎo)致植物發(fā)生細(xì)胞脫水和膜系統(tǒng)損傷等破壞[19]，通過滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫等對植物造成巨大傷害[20]。本研究結(jié)果中GO富集分析表明，CK-T比較組和T-S比較組共有差異表達(dá)基因富集較多的分類為膜和膜的組成部分等。已有報(bào)道H2S通過上調(diào)楊樹根系胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體系，促進(jìn)Na+和H+逆向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，而且H+泵通過抑制去極化激活的離子通道來限制鹽誘導(dǎo)的K+外流，從而調(diào)節(jié)鹽脅迫下楊樹根系K+/Na+的平衡[21]。這說明H2S能夠通過調(diào)節(jié)鹽脅迫下植物組織細(xì)胞離子平衡及氧化還原過程，減輕膜損傷，調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白從而緩解鹽脅迫引起的損傷。

遭遇滲透脅迫時(shí)，植物會通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來減少蒸騰失水，從而維持體內(nèi)水分代謝的相對平衡[22]。目前，鹽超敏感信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Salt overly sensitive，SOS)、鈣依賴型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CDPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)途徑、脫落酸(Abscisic acid，ABA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)級聯(lián)反應(yīng)途徑等是植物應(yīng)答鹽脅迫相關(guān)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[23]。植物體內(nèi)的H2S主要是通過L-/D-半胱氨酸脫氫酶(L-/D-cysteine desulfhydrase，L-/D-CDes)途徑合成，H2S位于SOS上游，參與鹽脅迫、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、ABA等誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉過程[24-26]。本研究結(jié)果中KEGG富集分析表明，CK-T和T-S比較組差異表達(dá)基因主要富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣滲透應(yīng)力門控陽離子通道、氮代謝、α-亞麻酸代謝、茉莉單酰-L-氨基酸水解酶和鉀通道代謝通路。和CK組相比，NaCl處理組CSC1樣蛋白ERD4基因、NADH型硝酸還原酶樣基因、蛋白質(zhì)TIFY10B樣基因、丙二烯氧化物環(huán)化酶基因(Allene oxide cyclase，AOC)、BTB/POZ和TAZ結(jié)構(gòu)域蛋白1樣基因、麥冬蛋白-3樣基因、絲裂原激活蛋白激酶激酶3樣基因、轉(zhuǎn)錄因子bHLH18樣基因和IAA-氨基酸水解酶ILR1樣4基因下調(diào)，而H2S處理后上述基因上調(diào)，鉀通道AKT1基因在NaCl脅迫和H2S處理后均上調(diào)表達(dá)。研究表明AOC基因參與對鹽脅迫、金屬離子、損傷、JA、ABA及水楊酸(Salicylic acid，SA)的響應(yīng)等，是JA生物合成途徑中一個(gè)關(guān)鍵酶，在植物抗逆境反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[27]。SA信號途徑和JA信號途徑被認(rèn)為是相互拮抗的2條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[28]；CSC1樣蛋白ERD4基因參與膜和膜的組成，具有ERD4的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物生長旺盛，產(chǎn)量高，并且對鹽和滲透脅迫具有耐受性[29]；NADH型硝酸還原酶基因的表達(dá)與高濃度鹽脅迫下，鹽敏感蕎麥品種葉片NADH型硝酸還原酶活性顯著降低研究一致[30]；TIFY蛋白質(zhì)構(gòu)成植物特有的超家族，它們參與調(diào)節(jié)許多植物過程，例如發(fā)育、防御和脅迫反應(yīng)[31]；MAPK在植物的應(yīng)激反應(yīng)和發(fā)育中起著重要作用[32]；AKT表達(dá)與植物的Na+選擇性密切相關(guān)[33]。植物耐鹽性是由植物體內(nèi)一系列因素共同作用的結(jié)果，同時(shí)受外界環(huán)境因子的影響和制約。鹽脅迫后，黃瓜在一系列代謝的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因的調(diào)控下，維持機(jī)體代謝相對平衡，并適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。研究鹽脅迫相關(guān)基因及其功能分析為下一步篩選耐鹽關(guān)鍵基因提供了信息。