周大虎，瞿子揚，聶麗云， 劉嘉龍，傅軍如，唐文幫，賀浩華

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點實驗室，江西 南昌 330045； 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410128)

氮素是植物體生長發(fā)育所必需的大量營養(yǎng)元素之一，同時也是植物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)和葉綠素等許多重要物質(zhì)的組成成分；另外，在植物生長過程中氮素供給直接限制作物生長發(fā)育和產(chǎn)量構(gòu)成[1-2]。水稻是我國重要的糧食作物，為了保障糧食安全，先前氮肥的使用對水稻的產(chǎn)量發(fā)揮了重要作用。然而，近些年隨著氮肥的過量施用，作物對氮肥吸收效率逐漸降低，不僅作物增產(chǎn)效果不再明顯，土地也造成嚴(yán)重污染[3-4]。在水稻生產(chǎn)過程中，施氮量過高而利用率較低等已成為我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的嚴(yán)重問題[5-6]。我國目前水稻平均施氮量高出世界水平的75%，過量施用氮肥不僅導(dǎo)致生產(chǎn)成本不斷提高，收益越來越少，而且造成資源嚴(yán)重浪費，環(huán)境持續(xù)惡化，甚至降低了水稻的品質(zhì)[7-8]。因此，針對氮高效利用和耐低氮水稻品種少以及篩選方法的多樣性等問題，探索更加準(zhǔn)確可靠的耐低氮和氮高效篩選方法來篩選耐低氮和氮高效利用的種質(zhì)顯得尤為重要，進而挖掘水稻氮高效利用和耐低氮有利基因并闡明其遺傳機理，為培育耐低氮水稻新品種提供理論依據(jù)。

水稻種質(zhì)資源豐富，不同水稻品種的耐低氮特性及氮素利用率各不相同。因此，許多研究者利用不同耐低氮和氮高效利用指標(biāo)來篩選優(yōu)異種質(zhì)資源[9-11]。其中，有研究者把單株干物質(zhì)作為苗期氮素效率高低的篩選指標(biāo)[12]；還有研究者把葉綠素 SPAD 值作為氮高效水稻種質(zhì)的篩選指標(biāo)[13]。然而，鐘代斌等[14]認(rèn)為單一指標(biāo)鑒定可能帶來誤差，因此，把地上部干物質(zhì)量、苗期分蘗數(shù)和葉綠素含量 SPAD 值3個指標(biāo)的相對耐性指數(shù)作為篩選指標(biāo)[14]。同時，鄭家奎等[15]把株高、有效穗數(shù)、結(jié)實率、單株產(chǎn)量和生物產(chǎn)量作為篩選綜合指標(biāo)，并指出5項指標(biāo)均在90% 以上為耐低氮脅迫的水稻品種。除此之外，也有研究者結(jié)合育種實踐，篩選大面積種植品種的耐低氮特性。張寧[16]認(rèn)為采用與產(chǎn)量性狀相關(guān)的多個次級指標(biāo)進行篩選結(jié)果更加科學(xué)。樸鐘澤等[17]建議把有效穗、高結(jié)實率和高收獲指數(shù)作為篩選耐低氮水稻品種的參考指標(biāo)。趙祥等[18]用耐低氮綜合指數(shù)RITCM來評價水稻對低氮脅迫的耐受能力。李發(fā)橋等[19]根據(jù)相對產(chǎn)量(低氮條件下水稻產(chǎn)量/正常施氮條件下的產(chǎn)量)評價水稻品種的耐低氮能力?？傊叭艘话悴捎弥苯予b定與評價性狀來進行比較，利用不同水稻品種依據(jù)耐低氮相關(guān)的生理生化及形態(tài)指標(biāo)進行篩選，但尚未形成一套可靠、準(zhǔn)確而實用的評價體系。

本研究結(jié)合前人的經(jīng)驗，以優(yōu)質(zhì)耐低氮地方品種鵝湖香稻和同等生育期的優(yōu)質(zhì)品種外引七號為試驗材料，通過苗期水培和全生育期桶栽的方法，嚴(yán)格控制施氮量，綜合前人耐低氮篩選指標(biāo)。將株高、根長、植株鮮質(zhì)量、植株干質(zhì)量、葉綠素含量、全氮含量作為苗期的篩選指標(biāo)，將株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量、單株產(chǎn)量、葉綠素含量和全氮含量作為全生育期的篩選指標(biāo)，依據(jù)苗期和成熟期的耐低氮評價指標(biāo)來比較兩品種耐低氮特性，同時檢測在不同施氮水平下，氮代謝途徑相關(guān)基因的表達水平，進一步探索鵝湖香稻耐低氮的分子機理。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

地方香型優(yōu)質(zhì)稻品種贛晚秈40號，又稱鵝湖香稻(EHXD)。該品種全生育期158 d，具有農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，群體整齊一致，株葉形態(tài)好，分蘗力較強，穗粒數(shù)適中，結(jié)實率高，熟期轉(zhuǎn)色好等特點。外引七號(WY7H)是大面積應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)稻品種。該品種全生育期155 d，具有株形適中，分蘗力較強，莖稈粗壯，葉片較挺等特點。因與鵝湖香稻生育期接近，便于氮肥處理和取樣檢測，故選用這2個品種來進行施氮處理，進而比較耐低氮特性。

1.2 試驗方法

1.2.1 苗期試驗 將兩品種種子用2%的次氯酸鈉溶液消毒30 min后，用去離子水沖洗干凈，在28 ℃培養(yǎng)箱中浸種2 d，然后在37 ℃恒溫箱中催芽2～3 d，挑選出長勢均一(芽長5 mm左右)的幼苗轉(zhuǎn)移至剪掉底部的PCR板上，放在塑料箱中先用去離子水培養(yǎng)至兩葉一心，然后再用營養(yǎng)液培養(yǎng)。營養(yǎng)液采用國際水稻所標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)液， 營養(yǎng)液設(shè)正常水稻營養(yǎng)液(N+，1.44 mmol/L NH4NO3)和低氮水稻營養(yǎng)液(N-，0.24 mmol/L NH4NO3) 2個處理[20]，每個處理設(shè)置5個重復(fù)。培養(yǎng)條件為：28 ℃ 14 h光照，22 ℃ 10 h黑暗。

在營養(yǎng)液中培養(yǎng)21 d后，選取每個重復(fù)中長勢均一的植株20株，調(diào)查其株高、根長；在選取的20株中每2株用萬分之一的天平稱取鮮質(zhì)量。調(diào)查完畢后放入105 ℃烘箱殺青30 min，然后置于70 ℃烘箱中烘干，再考察各個重復(fù)的干質(zhì)量，并稱取2 g分別用凱氏定氮法測總氮含量。

1.2.2 生育期試驗 在江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科技園網(wǎng)室中進行生育期桶栽試驗，塑料桶高24.0 cm、底部內(nèi)徑23.5 cm、上部外徑29.0 cm，每桶裝土20 kg，供試土壤為稻田0～20 cm耕層土。土壤理化性質(zhì)：pH值15.6，有機質(zhì)含量17.80 g/kg，堿解氮含量80.86 mg/kg，有效磷7.43 mg/kg，速效鉀225.11 mg/kg。

對2個試驗品種鵝湖香稻和外引七號進行正常氮(N+)和低氮(1/3 N+)處理。每桶3株，設(shè)置5個重復(fù)。磷肥作為底肥一次性施用5 g/桶，鉀肥施3 g/桶。正常施尿素4 g/桶，底肥2 g/桶，分蘗肥1.2 g/桶，穗肥0.8 g/桶。低氮處理按照正常施尿素的1/3，別的施肥方案不變。

在桶栽的分蘗期和抽穗期分別用葉綠素計(SPAD-502， 日本莫尼塔公司Monita，日本)測劍葉的SPAD值；用丙酮法測各時期劍葉葉綠素含量[21]；用凱氏定氮法(凱氏定氮儀，Kjeltec 8400，F(xiàn)OSS)測植株的全氮含量[22]。每個試驗處理，測3個生物學(xué)重復(fù)。待成熟期后，每個處理取5株考察單株有效穗、千粒質(zhì)量、每穗實粒數(shù)和穗粒數(shù)，并計算結(jié)實率和單株產(chǎn)量。

1.2.3 熒光定量PCR檢測 分別取水培苗期和桶栽分蘗期新鮮葉片，液氮速凍保存。提取總RNA，采用TaKaRa提取總RNA試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit Code No. 9767)， 步驟參照說明書。利用瓊脂糖凝膠檢測RNA完整性；利用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.) 微量分光光度計檢測RNA質(zhì)量及濃度。反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa公司 PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (Code No.6110A) 試劑盒的說明書進行。RT-PCR使用TaKaRa公司的SYBR?Premix ExTaqTMⅡ Kit (Tli RNaseH Plus) 進行試驗。在Applied Biosystems的ABI PRISM 7500 HT RT-PCR儀上進行反應(yīng)，水稻的OsACTIN基因作內(nèi)參，試驗中所得到的CT值(樣品達到域值水平的循環(huán)數(shù))的范圍為15～28較為合理，試驗數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-ΔCT方法分析處理，每個PCR反應(yīng)時間均使用3個生物學(xué)重復(fù)，所用RT-PCR引物見表1。

表1 RT-PCR所用引物Tab.1 RT-PCR primers

1.3 分析方法與數(shù)據(jù)處理

使用SSPS 13.0(SPSS Inc.，芝加哥伊利諾伊大學(xué))和Microsoft Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用獨立樣本t檢驗分析低氮處理與正常條件下各性狀的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期水培耐低氮表型分析和耐低氮指標(biāo)分析

在低氮條件下水培處理21 d后，與鵝湖香稻比較，外引七號植株在低氮處理下明顯變矮小，且葉色變淡，而鵝湖香稻在處理前后的差異較小(圖1)，說明鵝湖香稻具有較強的耐低氮特性。另外，在低氮脅迫條件下，植株根系往往會為了獲取更多的氮營養(yǎng)而變得更復(fù)雜，即根長增加、根直徑變大、根數(shù)增多和根表面積增加等，通過比較苗期水培低氮處理后兩品種的根系變化可以發(fā)現(xiàn)，鵝湖香稻在低氮處理后根系有明顯增多，而外引七號根系在低氮處理后的根系變短、變細(圖1)，這進一步說明鵝湖香稻比外引七號具有更強的耐低氮脅迫特性。

A.鵝湖香稻苗期水培表型；B.外引七號苗期水培表型。 A.EHXD phenotype of the seedling stage under hydroponic conditions； B.WY7H phenotype of the seedling under hydroponic conditions.

為了進一步比較兩品種的耐低氮特性，檢測水培條件下正常氮和低氮處理下各項耐低氮指標(biāo)。結(jié)果(表2、圖2)表明：低氮脅迫與正常氮比較鵝湖香稻的株高、植株鮮質(zhì)量、植株干質(zhì)量、葉綠素含量和全氮含量均無顯著差異，但是在低氮條件下，根長顯著長于正常氮條件；而外引七號植株鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量和全氮含量都顯著低于正常氮條件(P<0.05)。

表2 苗期耐低氮各項篩選指標(biāo)比較分析Tab.2 Comparative analysis of screening indexes for low nitrogen tolerance in seedling stage

不同小寫字表示處理間0.05 水平上差異顯著。圖3-4同。 Different small letters are significantly different at the 0.05 probability level among treatments.The same as Fig.3-4.

2.2 生育期耐低氮指標(biāo)分析

為了進一步分析鵝湖香稻的耐低氮特性，本研究進行不同施氮處理生育期桶栽試驗，分別在分蘗期和抽穗期，對重要的耐低氮指標(biāo)SPAD值、葉綠素(以鮮質(zhì)量計)含量和植株全氮含量檢測分析。結(jié)果表明，在分蘗期，鵝湖香稻在正常氮和低氮水平下，各指標(biāo)均無顯著差異，而外引七號各指標(biāo)在低氮處理下均顯著低于正常氮條件(圖3-A-C)；在抽穗期，外引七號的各指標(biāo)同樣在低氮處理下均顯著低于正常氮條件；鵝湖香稻僅有SPAD值在低氮處理顯著低于正常氮處理，其他指標(biāo)均無顯著差異(圖3-D-F)。這些結(jié)果進一步表明，鵝湖香稻比外引七號具有更強的耐低氮特性。

2.3 農(nóng)藝性狀比較分析

為了進一步分析兩品種的耐低氮特性，本研究分別考察了低氮和正常氮條件下兩品種的各農(nóng)藝性狀指標(biāo)。結(jié)果表明：鵝湖香稻在低氮處理和正常氮條件下株高、有效穗數(shù)、穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒質(zhì)量和單株產(chǎn)量均無顯著差異；而外引七號在低氮條件下的株高、有效穗數(shù)及單株產(chǎn)量顯著低于正常氮條件，而其他3個農(nóng)藝性狀并沒有顯著差異(表3)。這些結(jié)果說明，低氮脅迫對水稻的株高、有效穗數(shù)和單株產(chǎn)量影響較大，因而這3個農(nóng)藝性狀可以作為耐低氮的篩選指標(biāo)。

2.4 氮代謝途徑調(diào)控基因表達分析

植物氮代謝同化途徑GS/GOGAT循環(huán)中，OsNADH-GOGAT1、OsNADH-GOGAT2和OsFD-GOGAT3個基因起到重要作用，另外耐低氮重要基因TOND1也參與了氮代謝調(diào)控途徑，為了進一步探索鵝湖香稻耐低氮的分子調(diào)控機制，本研究檢測了這4個基因在不同施氮水平下表達情況。在苗期水培條件下，這4個基因在鵝湖香稻的正常氮和低氮條件下沒有顯著差異表達，而在外引七號的低氮條件下表達量均顯著低于正常氮條件(圖4-A)。在分蘗期，OsNADH-GOGAT1、OsNADH-GOGAT2和OsFD-GOGAT這3個基因在鵝湖香稻中未存在顯著差異表達，而TOND1基因在低氮脅迫下表達量顯著高于正常氮條件；而對于外引七號，除了基因TOND1表達量無顯著差異之外，其他3個基因在低氮條件下表達量均顯著低于正常氮條件(圖4-B)。這些結(jié)果證實了鵝湖香稻在低氮水平下，氮代謝同化途徑中的重要基因表達量并未受到顯著抑制，而水稻中重要的耐低氮基因TOND1表達量則顯著增加，這也進一步從分子層面驗證了鵝湖香稻耐低氮特性。

A-C.桶栽分蘗期耐低氮指標(biāo)比較分析；D-F.桶栽抽穗期耐低氮指標(biāo)比較分析。 A-C.Comparative analysis of low nitrogen tolerance indexes at the tillering stage of barrel planting； D-F.Comparative analysis of low nitrogen tolerance indexes at the heading stage of barrel planting.

表3 生育期耐低氮篩選指標(biāo)比較分析Tab.3 Comparative analysis of screening indexes for low nitrogen tolerance in growth period

A.水培苗期相關(guān)基因的表達水平；B.桶栽分蘗期相關(guān)基因的表達水平。 A.Expression levels of related genes in hydroponics at the seedling stage；B.Expression levels of related genes at the tillering stage of barrel planting.

3 討論與結(jié)論

許多野生稻和地方品種均含有耐低氮的特性，挖掘這些耐低氮種質(zhì)資源，應(yīng)用于耐低氮品種培育是提高氮肥利用率的有效措施。研究者非常重視挖掘各個地方品種以及野生稻衍生系的耐低氮特性評價與篩選[23-24]。本研究在前人耐低氮種質(zhì)資源篩選評價指標(biāo)的基礎(chǔ)上，結(jié)合苗期水培和全生育期桶栽的方式來開展不同氮處理試驗，該方法能更精確的控制施氮水平，避免在田間由施氮不均造成的數(shù)據(jù)誤差。本研究在苗期水培和全生育期桶栽條件下，低氮脅迫處理外引七號植株形態(tài)和評價指標(biāo)大多數(shù)出現(xiàn)顯著差異，而鵝湖香稻則未出現(xiàn)顯著差異變化，這充分說明鵝湖香稻具有較強的耐低氮脅迫特性。

前人研究發(fā)現(xiàn)，大部分氮高效品種在低氮條件下一般都具有更發(fā)達的根系，進而更適宜吸收營養(yǎng)元素[25]。本研究苗期水培條件下，能明顯的觀察到鵝湖香稻根系更加發(fā)達，這與前人研究結(jié)果一致。另外，在前人評價水稻耐低氮指標(biāo)中，很少測定植株全氮含量，本研究在不同施氮條件下，測定兩品種不同時期的全氮含量，很直觀的表明優(yōu)質(zhì)地方品種稻鵝湖香稻在低氮條件下植株全氮含量并沒有顯著減少，說明鵝湖香稻自身具備氮高效吸收能力，但植株體內(nèi)的氮素轉(zhuǎn)運機制還需進一步研究。

為了讓耐低氮種質(zhì)資源更方便的應(yīng)用于水稻育種中，不僅研究者要建立高效的水稻耐低氮和氮高效評價體系，同時要進一步挖掘和利用水稻自身的氮高效和耐低氮基因。近些年，對水稻氮吸收、轉(zhuǎn)運和利用相關(guān)基因的克隆研究也受到重視，一些相關(guān)基因被陸續(xù)報道[26-29]。Zhang等[28]克隆的水稻耐低氮關(guān)鍵基因TOND1表達水平可以直接的反映水稻的耐低氮水平。在植物體內(nèi)，谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合成酶(GOGAT)循環(huán)途徑是銨根離子同化的主要途徑，GS/GOGAT循環(huán)途徑產(chǎn)生的谷氨酸和谷氨酰胺可進一步合成蛋白質(zhì)，是植物能量來源重要途徑之一[30-33]，檢測該循環(huán)途徑的相關(guān)基因表達水平可以從分子層面反映植物的氮吸收水平。因此，本研究結(jié)合前人的報道結(jié)果，對參與水稻氮代謝重要的GS/GOGAT循環(huán)途徑相關(guān)基因和耐低氮重要基因TOND1進行表達分析，尤其是鵝湖香稻中的TOND1基因，在低氮條件下依然可以高水平表達，這進一步從分子層面表明鵝湖香稻的耐低氮特性。然而，對于優(yōu)質(zhì)地方品種鵝湖香稻的自身耐低氮基因挖掘還有待進一步研究。

總之，本研究對鵝湖香稻和外引七號耐低氮特性，進行了充分篩選和鑒定，得出優(yōu)質(zhì)地方品種鵝湖香稻在低氮脅迫條件下，苗期株高、植株鮮質(zhì)量和干質(zhì)量都不存在顯著差異；生育期農(nóng)藝性狀也均無顯著差異，這些結(jié)果都表明鵝湖香稻具有優(yōu)良的耐低氮和氮高效特性，這為進一步充分挖掘鵝湖香稻耐低氮相關(guān)基因，利用其遺傳優(yōu)勢來培育耐低氮水稻新品種奠定了基礎(chǔ)，對減少氮肥投入、減輕環(huán)境污染具有十分重要的意義。