廖行偉 黃巧 翟思佳 尹時華

廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（南寧530007）

p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員，共有6個亞型，包括p38α1/α2、p38β1/β2、p38γ和p38δ[1]。p38MAPK在去磷酸化狀態(tài)下無活性，當細胞受到紫外線、炎性因子、細胞因子、DNA損傷等刺激后，p38MAPK被激活磷酸化，磷酸化的p38MAPK(p-p38)可活化一系列底物如轉錄因子、蛋白激酶、胞漿和胞核蛋白等，引發(fā)炎癥反應、細胞分化、細胞周期停滯、凋亡、衰老、細胞因子產(chǎn)生以及RNA剪接調(diào)控等，且這種活化作用通常具有組織細胞特異性[2]。

梅尼埃病是一種以波動性聽力損失和前庭功能障礙為主要表現(xiàn)的疾病，主要由于內(nèi)耳內(nèi)環(huán)境紊亂和淋巴囊系統(tǒng)調(diào)節(jié)失效，導致膜迷路積水從而引起相應癥狀[3，4]。水通道蛋白（AQP）是存在于哺乳動物和植物細胞膜上的特異孔道，其功能是介導水在細胞的跨膜轉運，維持生命基本活動[5]。在豚鼠膜迷路積水模型研究發(fā)現(xiàn)，膜迷路積水可能與AQP2的表達上調(diào)有關[6]。而在小鼠腎臟集合管細胞中，通過p38MAPK途徑能夠改變AQP2蛋白酶體降解，增強AQP2在腎臟的表達[7]。p38MAPK是否通過調(diào)控AQP2參與內(nèi)耳膜迷路積水形成并不清楚，本實驗期望通過研究p38MAPK在豚鼠內(nèi)耳中的表達，以進一步深入了解膜迷路積水、梅尼埃病的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

P38MAPK兔抗鼠單克隆抗體購自美國CST公司；SBAC二抗試劑盒、過氧化物酶阻滯劑及DAB顯色劑均購自boster公司；TRIZOL購自TaKaRa公司；逆轉錄盒與熒光定量PCR試劑盒均購于天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物公司合成并經(jīng)過質(zhì)量檢驗。

1.2 實驗動物選擇與取材

選取耳廓反射靈敏體重250-300g的健康紅目豚鼠10只，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，并排除聽性腦干反應（ABR）檢測閾值大于40dBSPL和畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射（DPOAE）不通過者。

1.2.1 ABR和DPOAE檢測

以10%水合氯醛（0.5～0.6ml/100g）腹腔注射麻醉滿意后對豚鼠進行ABR測試，記錄電極置于額頂正中，參考電極接測試耳乳突，鼻尖接地，極間電阻小于1kΩ。click短聲刺激，強度90dBSPL到0 dBSPL，衰減間隔10dB，接近閾值時，衰減間隔5 dB，帶通濾波300～3000Hz，刺激速率為21次/秒，疊加1024次。以能引出可分辨Ⅱ波的最小刺激強度為反應閾值，并重復檢測2次。隨后進行DPOAE幅度測試，將f2/f1比率固定在1.20，刺激聲強度L1=65dB SPL，L2=70dB SPL，取2k、3k、4k、6k、8k、10k共6個頻率點進行測試，記錄各頻率左、右耳的平均DPOAE反應幅值。

1.2.2 實驗動物取材

豚鼠按40mg/kg1%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉，打開胸腔予以生理鹽水進行心臟灌注，至口唇蒼白后換為4%多聚甲醛繼續(xù)灌注，待頸僵直后迅速斷頭、取出聽泡后剝離耳蝸，同時取出腎組織。再將耳蝸置于4%多聚甲醛中，在4℃冰箱內(nèi)固定48h。10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣1月，期間隔天更換脫鈣液。將已脫鈣的耳蝸于各梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，以4um的厚度沿蝸軸切片。

1.3 qRT-PCR

將豚鼠麻醉、灌注后迅速取出雙側耳蝸，置入RNA保存液中，在解剖顯微鏡下剝離蝸殼，取出膜迷路組織，迅速放入已加入300μl TRIZOL的1.5mLEP管中，用玻璃研磨棒在EP管中快速研磨碎，另加入 700μl TRIZOL，冰上放置 10min。按Trizol試劑盒說明嚴格操作，提取總RNA，然后將RNA溶于無酶水中，微量核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度。將mRNA反轉錄為cDNA，qRT-PCR檢測樣本p38MAPK表達，反應條件：95℃15min，95℃15s，60℃30s，總共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，每組設3個復孔，重復3次。引物序列：p38MAPK F:5'-CAGCTTCAGCAGATTATGCGT-3'，R:5'-AGCCACTGGTTCATCGTCAG-3'；β -actin F:5'-GCCAACCGTGAGAAGATGAC-3'，R:5'-AGGCATACAGGGACAGCACA-3'。

1.4 免疫組化

65℃烤箱烤片2h，二甲苯脫蠟1h，將切片依次放入100%、95%、80%、75%乙醇純化各5min，檸檬酸緩沖液高壓修復7min，離開熱源自然冷卻，棄去抗原修復液，PBS淋洗5min，將切片移入濕盒中加入過氧化物酶阻滯劑，以去除內(nèi)源性過氧化物酶封閉液，室溫孵育10min，PBS充分淋洗5min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min，水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗(p38MAPK 1:100)，放入濕盒，4℃孵育過夜，37℃復溫1小時，滴加二抗工作液，室溫孵育1h，PBS充分淋洗，DAB顯色5min，PBS沖洗1min，蘇木精復染3分鐘，鹽酸酒精分化30s，飽和碳酸鋰返藍5min，脫水，透明，封片。腎臟做陽性對照，鏡下組織出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性。采用Image-ProPlus6.0計算耳蝸切片免疫組化陽性各部位平均光密度值（OD值）。

1.5 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)以SPSS23.0軟件處理，資料以均數(shù)±標準差（±s）進行統(tǒng)計描述。耳蝸各部位OD值比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有差異，GraphpadPrism8.0作圖。

2 結果

2.1 聽力測定結果

ABR豚鼠聽閾28.00±3.49dBSPL，DPOAE檢測通過，符合實驗動物要求。

圖1 豚鼠ABR聽閾測定結果Fig.1 The results of guinea pig ABR hearing threshold measurement

圖2 豚鼠DPOAE測定結果Fig.2 The results of guinea pig DPOAE measurement

2.2 qRT-PCR

豚鼠耳蝸樣本中p38MAPK mRNA顯示指數(shù)增長，并達到平臺期，其擴增曲線為一組典型的倒S型曲線，擴增效率較高（圖3a），PCR產(chǎn)物熔解溫度均一，熔解曲線峰型單一，產(chǎn)物特異性好（圖3b）；p38MAPK mRNA在正常豚鼠耳蝸中的表達量為1.0733±0.2608（圖3c）。

圖3 豚鼠耳蝸樣本中p38MAPK mRNA顯示指數(shù)增長，并達到平臺期，其擴增曲線為一組典型的倒S型曲線，擴增效率較高（a）；PCR產(chǎn)物熔解溫度均一，產(chǎn)物熔解曲線峰型單一，產(chǎn)物特異性好（b）；p38MAPK在正常豚鼠耳蝸中的表達量為1.0733±0.2608（c）Fig.3 The mRNA of p38MAPK in guinea pig cochlear samples showed exponential growth and reached plateau.The amplification curve was a typical inverted S-shaped curve with higher amplification efficiency(a);PCR production melting temperature is uniform,The peak type of product melting curve is single and the specificity of product is good(b);The mRNA relative expression of p38MAPK in the normal guinea pig cochlea is 1.0733±0.2608(c)

2.3 免疫組化

以p38MAPK在腎臟的表達作為陽性對照，p38MAPK主要表達于腎集合管（圖4a）。以生理鹽水代替p38MAPK一抗作為實驗的陰性對照，見耳蝸各部位無顯色（圖4b）。P38MAPK在豚鼠耳蝸中廣泛表達于血管紋（StV）、螺旋韌帶（SPL）、前庭膜（RM）、Corti器（OC）、螺旋緣（SLM）、螺旋神經(jīng)節(jié)（SG）（圖4c-g）。其中螺旋神經(jīng)節(jié)相對于其他部位表達較弱，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001，圖5），余部位表達無明顯差異（P＞0.05）。

圖4 p38MAPK主要表達于腎集合管（a）；以生理鹽水代替p38MAPK一抗作為實驗的陰性對照，見耳蝸各部位無顯色（b）；P38MAPK在豚鼠耳蝸中廣泛表達于StV、SPL、RM、OC、SLM、SG，在SG處表達相對較弱（c-g）Fig.4 p38MAPK is mainly expressed in the renal collecting duct(a);physiological saline is used instead of p38MAPK primary antibody as a negative control of the experiment,and no coloration occurs in various parts of the cochlea(b);P38MAPK is widely expressed in StV in the guinea pig cochlea,SPL,RM,OC,SLM,SG,expressed relatively weakly at SG(c-g).

圖5 SG相對于其他部位表達較弱，差異具有統(tǒng)計學意義，余部位表達無明顯差異。Fig.5 SG is weakly expressed relative to other parts,the difference is statistically significant,and there is no significant difference in the expression of the remaining parts.

3 討論

內(nèi)耳是充滿液體的感覺器官，將機械刺激轉化為聽覺和平衡感。這些神經(jīng)感覺功能依賴于內(nèi)耳的兩個主要細胞外液區(qū)—外淋巴和內(nèi)淋巴的體積的嚴格調(diào)節(jié)。水通道蛋白家族（AQPs）是精確調(diào)節(jié)外淋巴和內(nèi)淋巴體積的分子候選物[8]。已經(jīng)在內(nèi)耳的膜迷路中鑒定出八種AQP亞型。類似的AQP亞型也在腎臟中表達，其在全身水調(diào)節(jié)中起作用。在內(nèi)耳中，AQP亞型在不同的細胞類型中普遍表達，表明AQP在外淋巴和內(nèi)淋巴的體積調(diào)節(jié)中具有重要的生理作用。此外，受干擾的AQP功能可能具有病理生理學相關性，并可能將AQP轉變?yōu)橹委焹?nèi)耳疾病的治療靶點[9]。

P38MAPK與AQP家族關系密切。在急性CO中毒大鼠腦水腫模型中，AQP1和AQP4參與促進了CO中毒誘導腦水腫的發(fā)生發(fā)展進程，而抑制p38MAPK通路則能夠明顯抑制這種誘導效應[10]。在大鼠敗血癥模型中，抑制P38MAPK的炎性細胞因子和磷酸化可以上調(diào)AQP5的表達，從而保護膿毒癥大鼠的肺組織[11]。激活后的p38MAPK可以誘導AQP3的表達下調(diào)和AQP9的表達上調(diào)，兩者相結合參與油酸誘導的肝脂肪變性[12]。AQP8能夠增加過氧化氫誘導的p38MAPK的磷酸化[13]。p38抑制劑可以抑制培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中的AQP4和AQP9表達[14]。而在小鼠腎臟集合管細胞中，通過p38MAPK途徑能夠改變AQP2蛋白酶體降解，增強AQP2在腎臟的表達[7]。在豚鼠膜迷路積水模型研究發(fā)現(xiàn)，膜迷路積水與AQP2的表達上調(diào)有關[6]?；诖耍覀兒侠硗茰yp38MAPK可能通過調(diào)控AQP2參與膜迷路積水的形成。

研究發(fā)現(xiàn)，AQP2在大鼠耳蝸血管紋（SV）的基底細胞、上皮下組織中的II型纖維細胞、內(nèi)毛細胞（IHC）、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞表達較強，而在外毛細胞（OHC）中表達相對較弱[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，p38MAPK廣泛表達于豚鼠血管紋、螺旋韌帶、cori器、螺旋緣、螺旋神經(jīng)節(jié)，這與AQP2在耳蝸的表達部位大致相當，更加增大了p38MAPK通過調(diào)控AQP2參與膜迷路積水的形成的可能性，當然這需要我們在下一步的研究中進一步證實。上皮鈉通道（ENaC）作為高選擇性Na+通道，參與膜迷路積水的形成，而ENaC在豚鼠耳蝸中表達于血管紋、螺旋韌帶、前庭膜、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、螺旋緣等部位[16]，p38MAPK與此別無二致，p38MAPK是否也通過ENaC參與膜迷路積水形成，這在我們后續(xù)的實驗中有待進一步研究證實。

本實驗首次研究了p38MAPK在豚鼠耳蝸各部位的表達，發(fā)現(xiàn)p38MAPK的表達部位與AQP2及ENaC在耳蝸表達部位大致重合，我們合理推測p38MAPK可能通過調(diào)節(jié)AQP2及ENaC參與膜迷路積水的形成。