易志富龔鑫 楊雙丹

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（廣州510120）

聽皮層位于聽覺中樞通路的終端，是聽覺感知的最高級(jí)中樞。老年性聾又稱為年齡相關(guān)性聽力損失(age-related hearing loss，AHL)，是導(dǎo)致老年人交流障礙的常見原因，在臨床上尚無特效藥物治療。隨著老齡化的到來，老年性聾患者數(shù)量將會(huì)大量增長[1,2]，研究老年性聾的病因及治療手段變得愈為緊迫。

本研究利用D-半乳糖（D-galactose,D-gal）誘導(dǎo)的衰老大鼠模型[3-5]，實(shí)驗(yàn)觀察氧自由基清除劑α-硫辛酸（α-lipoic acid，α-LA）[6-8]對(duì)衰老大鼠聽皮層線粒體氧化損傷及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，從而探究α-硫辛酸治療中樞性老年性聾的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)48只4周齡雄性SD大鼠，體重61g～75g，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物室環(huán)境：室內(nèi)相對(duì)溫度（23±1）℃，相對(duì)濕度（50±10）%。所有動(dòng)物處死時(shí)均無中耳炎。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組（n=16）：① 對(duì)照組（NS）：腹腔注射生理鹽水500mg.(kg.d)-18周后，腹腔注射生理鹽水40mg.(kg.d)-18周；② 衰老組（D-gal）：腹腔注射D-半乳糖500mg.(kg.d)-18周后，腹腔注射生理鹽水40mg.(kg.d)-18周；③ 干預(yù)組（α-LA）：腹腔注射D-半乳糖500mg.(kg.d)-18周后，腹腔注射α-硫辛酸40mg.(kg.d)-18周。實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉方式：肌肉注射氯胺酮（30mg/kg）和氯丙嗪（15mg/kg）麻醉。

1.2 材料與試劑

D-半乳糖購自美國sigma公司，8-OHdG購自美國Abcam公司。H2O2、T-SOD、ATP、MMP檢測試劑盒均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)

各實(shí)驗(yàn)組選取4只大鼠，麻醉后經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水，沖凈血液后斷頭處死，取出顳葉聽皮層組織，2.5%戊二醛下固定至少2h。0.1M PBS清洗20min×4次，使用1%鋨酸后固定2 h，0.1M PBS清洗15min×5次。聽皮層組織行梯度脫水。浸入丙酮對(duì)半稀釋的低黏度包埋劑2h，再用低黏度包埋劑37℃烤箱滲透2h。于低黏度包埋劑中70℃烤箱內(nèi)包埋8h。進(jìn)行修塊，確保上下面平行，行超薄切片。枸櫞酸鉛與醋酸雙氧鈾雙重染色，電鏡下觀察線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)，拍照記錄。

1.4 線粒體功能指標(biāo)檢測

各實(shí)驗(yàn)組選取4只大鼠，快速分離雙側(cè)顳葉聽皮層組織，加入裂解液，冰上勻漿。裂解后4℃12000g離心5min，取上清，用于ATP含量測定。用ATP檢測試劑盒測定ATP含量。用組織線粒體分離試劑盒直接提取顳葉聽皮層組織的線粒體，并采用MMP檢測試劑盒測定MMP水平。

1.5 免疫組化分析

用免疫組織化學(xué)方法分析了DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷。16只大鼠（每組4只）的大腦在4℃下用4%多聚甲醛緩沖液固定過夜，脫水，最后包埋在石蠟中。依冠狀位切片，厚度約5μm。在二甲苯中脫蠟后，通過梯度濃度的乙醇進(jìn)行再脫水。脫水后，加入COX IV（1:100稀釋）與8-OHdG（1:200稀釋）一抗4℃過夜。次日用PBS沖洗3次，每次3min；加入羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗（稀釋1:500）室溫下孵育1h。繼而PBS沖洗3次，每次3min，用DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核。拍照采圖。

1.6 抗氧化指標(biāo)檢測

對(duì)12只大鼠（每組4只）的雙側(cè)顳葉聽皮層組織進(jìn)行快速分離，加入裂解液，冰上勻漿。裂解后4℃12000g離心5分鐘，取上清，用于測定H2O2與T-SOD。H2O2檢測試劑盒測定H2O2含量。BCA蛋白濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度；配制WST-8/酶工作液，加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液，37℃孵育30分鐘，在450nm波長處測定吸光度，T-SOD檢測試劑盒測定T-SOD活性水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

由SPSS16.0軟件行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行多因素方差分析，確定差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 α-硫辛酸對(duì)線粒體結(jié)構(gòu)的影響

與對(duì)照組相比，衰老組聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞明顯，線粒體體積腫脹，線粒體嵴消失，基質(zhì)出現(xiàn)透明化，甚至出現(xiàn)空泡，干預(yù)組線粒體的超微結(jié)構(gòu)，相較衰老組改善明顯（圖1）。

圖1 聽皮層神經(jīng)元細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)（3000×）。NS：對(duì)照組；D-gal：衰老組；α-LA：干預(yù)組。N：細(xì)胞核；M：線粒體。標(biāo)尺=0.5μm。Fig.1 Ultrastructure of neuron cells in auditory cortex（3000×）.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.N:nuclei;M:mitochondrion.Scale=0.5 μ M.

2.2 α-硫辛酸對(duì)線粒體功能的影響

對(duì)照組、衰老組與D-半乳糖+α-硫辛酸組大鼠聽皮層組織的水平分別為12.80±1.90 nmol/mg protein、6.25±1.53 nmol/mg protein與 8.99±0.42 nmol/mg protein，衰老組顯著低于對(duì)照組（F=6.5785,P＜0.001），而干預(yù)組顯著高于衰老組（F=3.6731,P=0.017）（圖2A）；對(duì)照組、衰老組與 干預(yù)組大鼠聽皮層線粒體膜電位水平分別為6.13±1.25、3.41±0.29與5.02±1.38，衰老組顯著低于對(duì)照組（F=5.8196,P＜0.001），而干預(yù)組顯著高于衰老組（F=3.5402,P=0.022）（圖2B）。

圖2 （A）各組ATP含量；（B）各組MMP水平。NS：對(duì)照組；D-gal：衰老組；α-LA：干預(yù)組。*P＜0.05，**P＜0.01。n=4。Fig.2 (A)the content of ATP in each group;(B)membrane potential level of mitochondria in each group.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.*P＜0.05,**P＜0.01.n=4.

2.3 α-硫辛酸對(duì)DNA氧化損傷的影響

衰老組聽皮層組織含有大量的8-OHdG，且絕大部分與綠色的線粒體重合，提示8-OHdG的表達(dá)主要發(fā)生在線粒體,衰老組顯著高于對(duì)照組（F=11.918,P＜0.001），而干預(yù)組顯著低于衰老組（F=7.3322,P=0.001）（圖3A、B）。

圖3 （A）紅色熒光標(biāo)記8-OHdG，綠色熒光標(biāo)記線粒體，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核；（B）8-OHdG的定量分析。NS：對(duì)照組；D-gal：衰老組；α-LA：干預(yù)組。標(biāo)尺=20μm。**P＜0.01。n=4。Fig.3 (A)red fluorescence labeled 8-OHdG,green fluorescence labeled mitochondria,blue fluorescence labeled nuclei;(B)quantitative analysis of 8-OHdG.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group.Scale=20μM.**P＜0.01.n=4.

2.4 α-硫辛酸對(duì)氧化應(yīng)激水平的影響

對(duì)照組、衰老組與干預(yù)組聽皮層H2O2水平分別為13.09±1.23mmol/g protein、29.70±3.40mmol/g protein和18.60±1.13mmol/g protein，衰老組顯著高于對(duì)照組（F=14.407,P＜0.001），而干預(yù)組顯著低于衰老組（F=8.9269,P＜0.001）（圖4A）；對(duì)照組、衰老組與干預(yù)組聽皮層組織的T-SOD活性水平分別為 155.02±19.15U/mg protein、69.80±8.76U/mg protein和113.89±10.56U/mg protein，衰老組顯著低于對(duì)照組（F=6.0503,P＜0.001），而干預(yù)組顯著高于衰老組（F=4.6712,P＜0.001）（圖4B）。

圖4 （A）各組大鼠聽皮層H2O2水平；（B）各組大鼠T-SOD活性水平。NS：對(duì)照組；D-gal：衰老組；α-LA：干預(yù)組；**P＜0.01；n=4。Fig.4 (A)Levels of H2O2in the auditory cortex of rats in each group;(B)Levels of T-SOD activity in the rats in each groups.NS:control group;D-gal:aging group;α-LA:intervention group;**P＜0.01;n=4.

3 討論

據(jù)報(bào)道，D-gal注射可引起全身各系統(tǒng)氧化應(yīng)激和線粒體損傷[3-5]，類似于自然衰老大鼠所發(fā)生的改變。因此，D-gal已被用作衰老和抗衰老研究的動(dòng)物衰老模型[9]。α-LA具有干預(yù)性保護(hù)衰老過程中外周聽覺系統(tǒng)氧化損傷的作用[5]，但α-LA對(duì)衰老過程中中樞聽覺系統(tǒng)氧化損傷的影響尚未有探究。所以我們利用D-gal誘導(dǎo)的衰老模型研究α-LA在衰老大鼠聽皮層線粒體氧化損傷中的作用。

已有研究表明氧化應(yīng)激是導(dǎo)致老年性聾發(fā)病的重要因素[10-14]。機(jī)體活性氧簇（reactive oxygen species，ROS)的生成與清除失衡，進(jìn)而導(dǎo)致組織氧化損傷。膜脂質(zhì)、線粒體、蛋白、核基因均可被活性氧簇破壞，繼而損害細(xì)胞生理功能。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：在衰老大鼠聽皮層組織中，具有抗氧化作用的T-SOD顯著下降，且H2O2含量明顯增加，再次表明氧化應(yīng)激增加是導(dǎo)致老年性聾發(fā)病的重要因素。

氧化應(yīng)激會(huì)引起線粒體功能障礙。線粒體在體內(nèi)產(chǎn)生超過90%-95%的ATP,同時(shí)產(chǎn)生活性氧簇。隨著老化，機(jī)體抗氧化能力減弱，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)大分子物質(zhì)遭到破壞，導(dǎo)致凋亡增多[15,16]。在老化大鼠中，外周[3]及中樞聽覺系統(tǒng)[4]出現(xiàn)抗氧化失衡，繼而引起線粒體結(jié)構(gòu)破壞。通過本研究亦發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，衰老組大鼠聽皮層H2O2含量明顯上升，T-SOD顯著下降，機(jī)體抗氧化失衡，表明利用D-半乳糖可導(dǎo)致大鼠聽皮層氧化應(yīng)激增加；衰老組大鼠聽皮層組織中ATP和MMP顯著下降，而DNA氧化損傷標(biāo)記物8-OHdG在線粒體中的表達(dá)顯著上升，表明在D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠聽皮層組織中線粒體功能出現(xiàn)紊亂[4]。這些研究表明氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能障礙可能是導(dǎo)致老年性聾發(fā)病的重要因素。

α-LA是一種強(qiáng)抗氧化劑，兼具脂溶性與水溶性。α-LA具有多種抗氧化功能，可直接清除活性氧，減少炎癥反應(yīng)，抑制活性氧自由基產(chǎn)生[17,18]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸能夠緩解線粒體損傷[19]。本研究證實(shí)：α-LA可顯著降低聽皮層組織線粒體DNA和氧化損傷水平，增加ATP和MMP水平，改善線粒體功能，保護(hù)線粒體超微結(jié)構(gòu)。因此，α-LA具有干預(yù)性保護(hù)衰老過程中聽皮層組織氧化損傷的作用。