黃夢麗，張亭亭，薛 瑞，鄧 云，張有志

（1.安徽理工大學醫(yī)學院，安徽 淮南 232001；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850；3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京 100053）

抑郁癥的發(fā)病機制復雜，假說眾多［1］，當前臨床抗抑郁藥療效難以令人滿意，抑郁癥發(fā)病機制的研究及治療藥物的研發(fā)尚有許多問題亟待解決。諸多研究表明，抑郁癥與腸道疾?。ㄈ缒c易激綜合征）共患比率高，約50%～94%的腸易激綜合征患者同時患有抑郁、焦慮等精神障礙［2-3］。近年來，腸道菌群-腸-腦軸在精神疾病中的重要作用受到廣泛關(guān)注，研究表明，腸道菌群與抑郁癥的發(fā)病和治療密切相關(guān)［4］。

腸道菌群可能通過神經(jīng)、免疫和內(nèi)分泌途徑與中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生聯(lián)系。炎癥在抑郁癥病理機制中的作用一直以來備受關(guān)注，抑郁癥患者血清中炎癥標志物如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和c反應蛋白等的水平往往高于正常人，這可能與腸道菌群有關(guān)［5］。細菌的表面抗原可與表達在單核細胞、巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞表面的Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）相互作用，如TLR-4識別革蘭陰性菌表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）等抗原，誘發(fā)一系列促炎癥因子（如IL-6和TNF-α）的釋放［6-7］，動物腦內(nèi)注射LPS能直接引發(fā)中樞炎癥和抑郁癥狀，且常作為一種制備抑郁癥動物模型的手段［8］。應激刺激還可能導致腸道通透性增加，乃至“腸漏”。因此，在抑郁狀態(tài)下，腸道細菌還可自腸腔進入循環(huán)系統(tǒng)而誘發(fā)炎癥反應［5］。MCNABNEY等［9］發(fā)現(xiàn)腸道有益菌群具有抗炎作用，可降低促炎癥細胞因子水平，進而降低抑郁癥的發(fā)病率。

小補心湯方由代赭石、旋覆花、竹葉和淡豆豉4味中藥組成，前期研究證明其具有良好的抗抑郁作用［10］，其總黃酮提取物（代號XBXT-2）是其抗抑郁作用的主要有效部位［11］，但其抗抑郁作用機制尚不明確。本研究采用經(jīng)典的慢性不可預知性應激（chronic unpredictable stress，CUS）大鼠抑郁模型，探究XBXT-2的抗抑郁作用與腸道菌群的關(guān)系，并從腸-腦軸相關(guān)免疫炎癥角度進一步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

XBXT-2由傳統(tǒng)中藥復方小補心湯提取制備，中藥飲片均購自北京同仁堂藥店，代赭石∶旋覆花∶竹葉∶淡豆豉以2∶2∶1∶1（m/m）比例混合，采用以蘆丁為標準的比色法測定XBXT-2中的表觀黃酮含量為76.0%，具體提取制備和檢測方法見文獻［12］。鹽酸氟西汀（fluoxetine，F(xiàn)XT）由常州制藥有限公司惠贈，批號：20100801；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司；牛血清蛋白（borineserum albu?min V，BSA）購自美國Biotopped公司；小鼠抗大鼠TLR-4單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗大鼠離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium bind?ingadaptor molecule-1，IBA-1）單克隆抗體購自美國CST公司；大鼠抗大鼠IL-10單克隆抗體購自英國Abcam公司；大鼠IL-1β，IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購自美國Invitrogen公司。脫色搖床由海門其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；電子天平由德國Sartorious公司生產(chǎn)；Mill-Q超純水系統(tǒng)由美國Millipore公司生產(chǎn)；蛋白電泳裝置由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；化學/熒光發(fā)光成像系統(tǒng)由美國Alpha Innotech公司生產(chǎn)；超聲波破碎儀由美國Sonic公司生產(chǎn)；DYY-7C型電泳儀電源由北京六一儀器廠生產(chǎn)；Victor3型全自動酶標儀由美國Molecular DeviceS公司生產(chǎn)；冷凍式高速離心機由日本KUBOTA（3500）公司生產(chǎn)。

1.2 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，SPF級，220～240 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，許可證：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學研究院行為學實驗動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～24℃，濕度40%～70%，該動物實驗通過軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所行為藥理學研究中心實驗動物倫理審查。動物在飼養(yǎng)環(huán)境適應2 d后開始實驗。

1.3 糖水偏愛實驗

實驗前先進行糖水訓練：首先同時給予裝有1%蔗糖水的2個相同的水瓶，每8 h互換瓶子位置，共3次；而后動物禁食，將其中一個水瓶內(nèi)換成同體積純凈水，每8 h互換兩瓶子的位置，共5次。訓練后開始測試：大鼠禁食禁水8 h，而后同時給予裝有1%蔗糖水和同體積純凈水的2個水瓶，令大鼠自由飲用1 h，通過稱取測試前后水瓶的質(zhì)量，分別檢測大鼠對糖水和純凈水的飲水量（g），計算糖水偏愛率。糖水偏愛率（%）=糖水的飲用量/（糖水的飲用量+純凈水的飲用量）×100%）。應激程序結(jié)束后同方法再次測量大鼠糖水偏愛率［13］。

1.4 CUS大鼠抑郁模型的制備

參考PAPP等［14］的方法制備大鼠CUS模型。連續(xù)35 d每天給予1～2種刺激，并盡量使應激刺激符合不可預測性的特點。大鼠適應2 d后，按1.3測定基礎(chǔ)糖水偏愛率水平，并依據(jù)該指標均衡分為正常對照組、模型組、FXT 10 mg·kg-1組和XBXT-2 100 mg·kg-1治療組，每組10只。正常對照組給予正常食物和水，隨機給予模型組、FXT組、XBXT-2組大鼠以下刺激：夾尾2 min、45°傾斜籠飼養(yǎng)24 h、禁食24 h、禁水24 h、電擊2次（每次時長20 s，間隔20 s）、制動2 h、孤獨飼養(yǎng)12 h、通宵照明12 h、連續(xù)避光24 h、潮濕飼養(yǎng)24 h、冷水游泳（水溫8～10℃）5 min等。于應激第一天開始ig給藥，每日1次。每天稱量大鼠體質(zhì)量，應激程序結(jié)束后觀察大鼠抑郁樣行為變化，而后處死，取海馬和結(jié)腸組織樣本進行相應檢測。

1.5 曠場實驗

應激程序結(jié)束后3 d進行曠場實驗。采用圓形敞箱，直徑80 cm，高30 cm，底面用黑線分為18個面積相近的扇形。實驗時將大鼠從敞箱相同一角放入，記錄大鼠5 min內(nèi)的爬行格數(shù)（穿越底部方格數(shù)，穿越1格為1分）、站立次數(shù)（兩前肢離地或爬墻壁）及首次進入中心區(qū)的潛伏期。

1.6 新奇抑制攝食實驗

應激程序結(jié)束后5 d進行新奇抑制攝食實驗。采用方形敞箱（76 cm×76 cm×46 cm），中心放有30個大小相等的食丸。觀測時光線明亮。大鼠禁食48 h后從敞箱相同一角放入，記錄5 min內(nèi)的攝食潛伏期（開始咬食食丸，而不是僅嗅或玩弄食丸）。

1.7 ELISA法檢測海馬IL-1 β和IL-6及結(jié)腸IL-1 β和TNF- α表達水平

分別將大鼠海馬和結(jié)腸組織樣品研磨、離心，制備組織勻漿液，按試劑盒說明書步驟操作，用酶標儀于450 nm波長測定吸光度值（A450nm），通過標準曲線計算各組樣本炎癥因子濃度。

1.8 Western印跡法檢測海馬IBA-1和TLR-4及結(jié)腸IBA-1，TLR-4和IL-10表達水平

分別將大鼠海馬和結(jié)腸組織研磨、離心、定量，制備組織勻漿液，加入5×上樣緩沖液，沸水浴變性5～10 min，-80℃凍存?zhèn)溆谩?0 μg組織總蛋白在12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，半干式電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗〔IBA-1（1∶1000）；IL-10（1∶500）；β肌動蛋白（1∶5000）〕，4℃孵育過夜，加酶標二抗〔山羊抗兔IgG（1∶3000）；山羊抗小鼠IgG（1∶3000）；山羊抗大鼠IgG（1∶1000）〕室溫孵育1 h，用Alpha Innotech凝膠成色系統(tǒng)顯色成像。采用AlphaView SA軟件進行分析處理，以目標蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.9 Illumina Miseq PE300高通量測序與微生物多樣性分析檢測結(jié)腸內(nèi)容物菌群組成

于抑郁行為學實驗結(jié)束后將大鼠處死，立即解剖下腹部，取結(jié)腸部位成形糞便分置于無菌凍存管中，迅速置液氮中，后轉(zhuǎn)移凍存于-80℃冰箱。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina Miseq PE300高通量測序完成。MiSeq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學分析，基于qiime軟件進行主成分分析、β-多樣性和物種豐度等分析。

1.10 統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以±s表示，用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用Students′t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 XBXT-2對CUS模型大鼠抑郁行為的影響

行為學實驗結(jié)果（圖1）顯示，與正常對照組相比，慢性應激刺激5周后，模型組大鼠糖水偏愛率和曠場實驗站立次數(shù)顯著降低（P<0.05），首次進入曠場中心區(qū)的潛伏期和新奇抑制攝食潛伏期顯著延長（P<0.05）。與模型組相比，F(xiàn)XT組和XBXT-2組大鼠糖水偏愛率和曠場實驗站立次數(shù)顯著增加（P<0.05）；首次進入中心區(qū)的潛伏期和新奇抑制攝食潛伏期顯著降低（P<0.05）。提示XBXT-2在大鼠CUS模型中具有顯著的抗抑郁和抗焦慮作用。

Fig.1 Effect of total flaconoids extracted from Xiao?buxin-Tang（XBXT-2）on depression-like behaviors in chronic unpredictable stress（CUS）rats by sucrose preference test（A），open field test（B and C）and novelty suppressed feeding test（D）.The rats were subjected to separation and multiple stressors such as fasting，water depriva?tion and dampness for 35 d to establish the CUS model.The rats were ig given water（control and model group），F(xiàn)XT 10 mg·kg-1（FXT group）or XBXT-2 100 mg·kg-1（XBXT-2 group）once per day for consecutive 35 d.±s，n=8-10.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with model group.

2.2 XBXT-2對CUS模型大鼠腸道菌群組成的影響

腸道菌群測序分析結(jié)果（圖2）顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠腸道厚壁菌門（Firmicutes）/擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度比值增大，乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、毛螺菌科（Lachno?spiraceae）細菌比例升高，鼠桿菌科（Muribacula?ceae）、瘤球菌科（Ruminococcaceae）細菌比例降低；與模型組相比，F(xiàn)XT和XBXT-2組大鼠腸道厚壁菌門/擬桿菌門的相對豐度比值減小，XBXT-2組大鼠腸道乳酸桿菌科和毛螺菌科細菌比例降低，鼠桿菌科和瘤球菌科細菌比例升高，F(xiàn)XT組大鼠腸道鼠桿菌科和乳酸桿菌科細菌比例升高，毛螺菌科細菌比例下降。β-多樣性分析結(jié)果（圖3）顯示，各組大鼠各樣本菌群結(jié)構(gòu)有明顯的聚類特點。

Fig.2 Effect of XBXT-2 on gut microbiota composi?tion at phylum level（A）and family level（B）in CUS rats by species composition analysis.See Fig.1 for the rat treatment.n=8-9.

結(jié)果（表1）顯示，與正常對照組相比，模型組結(jié)腸有益菌如紅椿菌科（Coriobacteriaceae）、杜博斯拉菌屬（Dubosiella）顯著減少（P<0.05），致病菌紫單孢菌屬（Muribaculum）顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，XBXT-2組有益菌紅椿桿科、杜博斯拉菌屬顯著增加（P<0.05），紫單胞菌屬顯著減少（P<0.05）；FXT-10組有益菌顯著增加（P<0.05），紫單胞菌屬顯著減少（P<0.05）。

Fig.3 Effect of XBXT-2 on β-diversity analysis in CUS rats by species comparative analysis.See Fig.1 for the rat treatment.Principal coordinate analysis（PCoA）based on unweighted UniFrac distances of gut microbiota from the four rat groups is shown.The percentage of PCoA1 and PCoA2 ordinate reflects the relative level of species composi?tion in each sample area.If the species composition of the sample is more similar，the distance reflected in the PCoA map will be closer.n=8-9.

2.3 XBXT-2對CUS模型大鼠海馬中IBA-1，TLR-4，IL-1 β和IL-6表達水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖4）表明，與正常對照組相比，模型組大鼠海馬IBA-1和TLR-4水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，XBXT-2組大鼠海馬IBA-1和TLR-4水平顯著降低（P<0.05）。ELISA實驗結(jié)果（圖5）表明，與正常對照組相比，模型組大鼠海馬IL-1β和IL-6水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，F(xiàn)XT和XBXT-2組大鼠海馬IL-1β和IL-6水平顯著降低（P<0.05）。

2.4 XBXT-2對CUS模型大鼠結(jié)腸中IBA-1，TLR-4，IL-10，IL-1 β和TNF- α表達水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖6）表明，與正常對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸中IBA-1和TLR-4水平顯著升高（P<0.05），IL-10水平顯著降低（P<0.05）；與模型組比較，XBXT-2組大鼠結(jié)腸中IBA-1和TLR-4水平顯著降低（P<0.05），IL-10水平顯著升高（P<0.05）。ELISA實驗結(jié)果（圖7）表明，與正常對照組相比，模型組大鼠結(jié)腸IL-1β和TNF-α水平顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，XBXT-2組大鼠結(jié)腸IL-1β和TNF-α水平顯著降低（P<0.05）。

Tab.1 Effect of XBXT-2 on gut microbiota composition at gene level in CUS rats by species composition analysis

Fig.4 Effect of XBXT-2 on levels of ionized calcium bindingadaptor molecule-1（IBA-1）and Toll-like recep?tor 4（TLR-4）in hippocampal of CUS rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-quan?titative result of A.±s，n=3-4.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with model group.

Fig.5 Effect of XBXT-2 on levels of interleukin-1 β（IL-1 β）and IL-6 in hippocampal of CUS rats by ELISA.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=3-4.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with model group.

Fig.6 Effect of XBXT-2 on levels of IBA-1，TLR-4 and IL-10 in colon of CUS rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B was the semi-ququantitative result of A.±s，n=3-4.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with model group.

Fig.7 Effect of XBXT-2 on levels of IL-1 β and TNF- α in colon of CUS rats by ELISA.See Fig.1 for the rat treat?ment.±s，n=3-4.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with model group.

3 討論

XBXT出自南北朝陶弘景所著的敦煌莫高窟《輔行訣臟腑用藥法要》，原方用于氣血不足導致心包絡(luò)虛。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，該方具有抗抑郁作用［12］，其乙醇提取物XBXT-2是其抗抑郁的活性成分。本研究結(jié)果顯示，XBXT-2可顯著升高CUS模型大鼠糖水偏愛率和曠場實驗中站立次數(shù)；降低CUS模型大鼠的新奇抑制攝食潛伏期、曠場實驗中首次進入中心區(qū)的潛伏期，進一步明確了XBXT-2的抗抑郁和抗焦慮作用。

中藥以植物成分為主，多數(shù)以口服形式進入消化道，腸道菌群對中藥的代謝吸收有著重要的作用，同時許多中藥對腸道菌群的平衡產(chǎn)生影響，因此，中藥的起效機制可能與腸道菌群關(guān)系密切。多項研究提示，黃酮類植物成分可影響腸道菌群。GAO等［15］通過超臨界二氧化碳萃取羅布麻中黃酮化合物發(fā)現(xiàn)其具有抗菌活性；CHEN等［16］研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳黃酮能有效促進腸道中有益細菌（雙歧桿菌和乳酸菌）的增殖，調(diào)節(jié)人體腸道菌群。XBXT-2是XBXT發(fā)揮抗抑郁作用的藥效部位，以口服形式進入消化道。本研究結(jié)果顯示，XBXT-2可增加CUS模型大鼠有益菌數(shù)量，減少致病菌數(shù)量，使物種組成趨于正常，且XBXT-2對CUS模型大鼠腸道菌群的改善效應優(yōu)于FXT。提示XBXT-2發(fā)揮抗抑郁作用與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

AHMED等［17］發(fā)現(xiàn)，增加具有黏附腸道上皮能力的病原菌（如黏附侵襲性大腸埃希菌）可改變腸道的通透性，造成腸道微菌群的組成和功能發(fā)生改變，并通過調(diào)節(jié)炎性因子的表達誘發(fā)炎癥反應。JIAH等［18］采用社交失敗抑郁模型，發(fā)現(xiàn)應激易感大鼠可表現(xiàn)出更顯著的抑郁樣行為，移植應激易感大鼠腸道菌群的正常大鼠，其腹側(cè)海馬中的IBA-1和IL-1β的表達水平升高，而移植非應激易感大鼠腸道菌群的正常大鼠，未表現(xiàn)出抑郁行為和海馬炎癥因子水平的變化，提示腸道菌群可通過腸-腦軸誘導抑郁樣行為和炎癥的產(chǎn)生，進而影響大鼠受應激刺激導致抑郁的易感性。LPS是細菌細胞壁的組成成分，也是一種典型的TLR-4激動劑，LPS是介導腸道菌群影響機體免疫的關(guān)鍵信號物質(zhì)，可在腸道屏障受損狀態(tài)下導致局部炎癥，升高炎癥因子水平，而外周TNF-α和IL-1β等炎癥因子可隨血液循環(huán)到達腦組織，影響腦內(nèi)炎癥水平［19］。STEVENS等［19］通過對抑郁癥患者和健康志愿者的腸道菌群進行16S rRNA測序，發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者革蘭陰性桿菌豐度增加，LPS生物合成基因過量表達，兩者共同作用導致血漿中內(nèi)毒素水平升高，引起炎癥反應。以上研究提示，LPS激活TLR，是介導腸道菌群影響機體免疫的關(guān)鍵途徑，實際上其免疫激活模型是重要的抑郁動物模型。本研究結(jié)果表明，XBXT-2可降低CUS模型大鼠結(jié)腸和海馬促炎因子水平，還可降低結(jié)腸和海馬免疫細胞活性和TLR-4水平，提示XBXT-2調(diào)節(jié)腸道菌群抗抑郁的作用可能與減少致炎菌與機體相互作用，進而減少腸道和腦內(nèi)炎癥的免疫途徑有關(guān)。ZHANG［20］研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物可抑制小鼠體內(nèi)TNF-α和IL-1β等炎癥因子的分泌，并促進小鼠血清中抗炎因子IL-10的分泌，增強機體免疫功能，該研究為黃酮類藥物的免疫調(diào)節(jié)作用提供支持。

本研究的結(jié)果顯示，F(xiàn)XT在抗抑郁作用的同時，也可減輕結(jié)腸和海馬免疫炎癥水平，這與文獻報道一致。ZHAO等［21］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XT可降低抑郁大鼠血清中TNF-α和IL-6水平。JIANG等［22］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XT可降低抑郁患者TNF-α和IL-6水平，即FXT在發(fā)揮抗抑郁作用的基礎(chǔ)上可能具有抗炎作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)XT對CUS模型大鼠結(jié)腸和海馬TLR-4的表達均無顯著影響，提示其減輕炎癥的作用機制與XBXT-2不同，可能與腸道菌群無關(guān)。FXT減輕炎癥的作用在其抗抑郁效應中的貢獻尚不明確，有待進一步研究。

綜上所述，XBXT-2抗抑郁作用與調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)，其作用機制與減少腸道菌群與機體免疫細胞相互作用、進而減輕外周巨噬細胞和腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞活化誘發(fā)的腸-腦軸免疫炎癥有關(guān)。