趙志軍，王瑞卿，劉延波，劉 寧，王洪彬，孫西玉，4，潘春梅*

（1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院（酒業(yè)學(xué)院），河南 鄭州450046；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州450046；3.賒店老酒股份有限公司，河南 社旗473300；4.河南張弓老酒酒業(yè)有限公司，河南 寧陵476733）

我國濃香型白酒采用泥窖續(xù)糟，固態(tài)發(fā)酵工藝，歷來有“千年老窖，萬年糟”的說法。糟醅的質(zhì)量對濃香型白酒的釀造起著非常重要的作用[1]。糟醅是已發(fā)酵完畢等待蒸餾的物料[2]，是釀酒微生物代謝發(fā)酵的主要場所。微生物在其中進行糖化、酒化、酸化和酯化等一系列生化反應(yīng)過程[3]，所以糟醅中的微生物品質(zhì)影響著出酒率的高低和酒質(zhì)的優(yōu)劣[1]。

酵母作為糟醅發(fā)酵的主要功能菌之一，依據(jù)其功能可分為釀酒酵母和生香酵母[4-5]。釀酒酵母具有較強的產(chǎn)酒精能力，代謝產(chǎn)物主要是酒精。生香酵母對酸、醇有較強的酯化能力，產(chǎn)生的香氣物質(zhì)以酯類為主，還有醇類、酸類、醛類、酮類、胺類、芳香族類等[6-7]。這些香味物質(zhì)是產(chǎn)生酒體芳香及促進酒體豐滿的關(guān)鍵化合物[8]。現(xiàn)已報道的生香酵母包括異常漢遜酵母[9]、假絲酵母[10]、畢赤酵母[11]、異常威克漢姆酵母[12]等。作者旨在從賒店老酒的糟醅中分離得到優(yōu)良的產(chǎn)酯酵母菌菌株，并采用響應(yīng)面法對其培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期將其培養(yǎng)液投入窖池，為提高濃香型白酒基酒的質(zhì)量奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料來源釀酒糟醅：賒店老酒股份有限公司提供。

1.1.2 實驗試劑蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉等常規(guī)試劑：均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；青霉素：購自華北制藥集團動物保健品有限責(zé)任公司。

1.1.3 篩選培養(yǎng)基PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L。

1.1.4 活化培養(yǎng)基YEPD液體培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L。

1.1.5 發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基豆芽汁培養(yǎng)基：黃豆芽10 g，葡萄糖5 g，水100 mL。將新鮮黃豆芽洗干凈，小火煮沸0.5 h，用紗布過濾，補足水分。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠制造；GH-500隔水式培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；ZQLY-300S搖床：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋：常州方科儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 生香酵母的初篩稱取10 g混勻的糟醅于90 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，搖床28℃、120 r/min，培養(yǎng)24 h。用移液槍吸取菌懸液1 mL至9 mL無菌水中，并依次梯度稀釋至1×10-6倍，取稀釋度1×10-4、1×10-5、1×10-6的菌懸液各0.1 mL均勻涂布于添加80 mg/L青霉素的PDA固體培養(yǎng)基表面，置于28℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取長勢良好的單菌落劃線轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，28℃條件下培養(yǎng)72 h，長出的單菌落再次劃線至完全純化，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生香酵母的復(fù)篩對初篩保存的菌株進行活化復(fù)篩。每支保存的斜面試管菌種，挑取一環(huán)接種至YEPD液體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24 h，制成種子液。將制備好的種子液以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵產(chǎn)酯培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，恒溫?fù)u床28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)5 d，測定總酯產(chǎn)量（質(zhì)量濃度）。

1.3.3 總酯的測定總酯測定方法采用皂化中和滴定法[13]。

1.3.4 菌株鑒定

1）菌株形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化試驗 菌落形態(tài)觀察：將被檢菌用稀釋平板法在PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落的顏色、大小、表面形態(tài)、邊緣形態(tài)、質(zhì)地等并做記錄。

細(xì)胞形態(tài)鑒定：將平板上的菌落用接種針挑取一環(huán)制片，在顯微鏡下觀察。

初步生理生化試驗按照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[14]進行，主要包括糖發(fā)酵實驗、硝酸鹽利用實驗、類淀粉物質(zhì)生成實驗、脲酶實驗等。

2）菌株26S rDNA鑒定 使用酵母DNA基因組快速提取試劑盒提取酵母基因組DNA，酵母擴增引物為通用引物對NL1和NL4。反應(yīng)體系為50μL（San Taq PCR Mix預(yù)混液25μL，引物各2μL，DNA模板2μL，ddH2O 19μL）。PCR擴增條件：94℃，5 min；94℃，40 s，53℃，45 s，72℃，45 s，35個 循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取3μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，將PCR產(chǎn)物送交上海生物生工有限公司進行測序，將測序所得特定序列，在NCBI上通過BLAST程序進行同源性比較與分析，用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 篩選酵母培養(yǎng)條件的研究

1）初始pH對篩選酵母產(chǎn)酯量（質(zhì)量濃度）的影響 為了確定篩選酵母適宜培養(yǎng)的初始pH，用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)豆芽汁培養(yǎng)基的pH值，分別至3、4、5、6、7，接種所篩選得到的酵母，在28℃、120 r/min條件下，培養(yǎng)5 d，進行小型發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵液中總酯質(zhì)量濃度。

2）初始糖質(zhì)量濃度對篩選酵母產(chǎn)酯量的影響調(diào)節(jié)豆芽汁培養(yǎng)基的初始糖質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10 g/dL。恒溫?fù)u床28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結(jié)束后測發(fā)酵液總酯質(zhì)量濃度。

3）發(fā)酵時間對篩選酵母產(chǎn)酯量的影響 用豆芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)篩選出的酵母菌株，在28℃、120 r/min條件下培養(yǎng)。選取發(fā)酵開始后的第2、3、4、5、6、7天分別取樣測的發(fā)酵液總酯質(zhì)量濃度。

1.3.6 響應(yīng)面實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取相關(guān)性大的3個因素為自變量，以總酯的產(chǎn)量（質(zhì)量濃度）為指標(biāo)進行17組5個中心點的Box-Behnken響應(yīng)面分析[15-17]，每個因素均設(shè)3個平行。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理運用Excel 2013和Design-Expert 8.0.6軟件對實驗結(jié)果進行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 生香酵母的篩選結(jié)果

通過在PDA瓊脂平板上多次分離純化后，共分離出22株疑似酵母菌的菌株（菌落編號S1—S22），將純化的22株菌株進行篩選，其產(chǎn)酯結(jié)果見表1。由表1得到，在相同的培養(yǎng)條件下，酵母菌株S5發(fā)酵液總酯質(zhì)量濃度為4.67 g/L，產(chǎn)酯能力強，是比較理想的產(chǎn)酯酵母。因此，選用S5菌株進行后續(xù)試驗研究。

2.2 生香酵母鑒定結(jié)果

2.2.1 菌株形態(tài)和生理生化試驗結(jié)果對菌株S5進行菌落形態(tài)觀察，并劃線于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征，結(jié)果見圖1。菌株S5在PDA瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，邊緣整齊，表面光滑，中央凸起，有水果香氣。通過生理生化試驗，該菌株能發(fā)酵葡萄糖，能利用硝酸鹽，不能生成類淀粉物質(zhì)，能水解尿素。

表1 不同菌株發(fā)酵液中總酯產(chǎn)量Table 1 Total ester contents in fermentation broth of different strains

圖1 菌株S5的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strain S5

2.2.2 菌株的分子鑒定對菌株S5的26S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物進行序列測序。將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對分析，對比結(jié)果顯示S5菌株與現(xiàn)已有的異常威克漢姆酵母的同源性達100%，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。結(jié)合S5的形態(tài)，生理生化試驗結(jié)果以及S5的系統(tǒng)發(fā)育樹，可以確定S5為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。

2.3 初始pH對篩選酵母產(chǎn)酯量影響的結(jié)果

根據(jù)1.3.5中設(shè)定的發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值進行小型發(fā)酵試驗，結(jié)果見圖3。隨著初始pH的升高，發(fā)酵液中總酯質(zhì)量濃度顯著提高，pH為5時達到最大，然后隨pH升高發(fā)酵液中總酯的質(zhì)量濃度有所下降。說明該菌株在pH為5～6的培養(yǎng)基中有較好的產(chǎn)酯能力，尤其是在pH為5的時候達到最高，總酯質(zhì)量濃度為4.15 g/L。

圖2 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree

圖3 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酯量的影響Fig.3 Effect of initial pH of fermentation medium on the production of ester

2.4 初始糖質(zhì)量濃度對篩選酵母產(chǎn)酯量影響的結(jié)果

根據(jù)1.3.5中設(shè)定的發(fā)酵液初始糖質(zhì)量濃度，進行小型發(fā)酵試驗，結(jié)果見圖4。隨著發(fā)酵液初始糖質(zhì)量濃度的增加，發(fā)酵液總酯質(zhì)量濃度是先上升后下降。葡萄糖添加量為6 g/dL時總酯質(zhì)量濃度達4.13 g/L，表明菌株發(fā)酵產(chǎn)酯的最佳初始糖質(zhì)量濃度為葡萄糖添加量為6 g/dL。當(dāng)培養(yǎng)基的初始糖質(zhì)量濃度過高，培養(yǎng)基滲透壓會增大，影響生香酵母的產(chǎn)酯能力。

2.5 發(fā)酵時間對篩選酵母產(chǎn)酯量影響的結(jié)果

發(fā)酵時間對產(chǎn)酯量的影響見圖5。由圖5可知，發(fā)酵3 d時總酯質(zhì)量濃度最高，達到4.55 g/L。但隨著發(fā)酵時間的增長，發(fā)酵液的總酯質(zhì)量濃度下降與廖永紅等[18]在對3種產(chǎn)酯酵母總酯的生成特性研究時發(fā)現(xiàn)的結(jié)論一致，其可能原因是隨發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中難揮發(fā)性酯類也逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐讚]發(fā)性酯類或其他物質(zhì)所致，因此S5生成總酯的適宜發(fā)酵時間為3 d。

圖4 初始糖度對產(chǎn)酯量的影響Fig.4 Effect of initial sugar content on ester yield

圖5 不同發(fā)酵時間對總酯生成量的影響Fig.5 Effect of different fermentation time on total ester production

2.6 響應(yīng)面的結(jié)果與分析

2.6.1 回歸模型建立及方差分析在單因素的基

礎(chǔ)上，選取培養(yǎng)基初始pH（A），發(fā)酵時間（B），培養(yǎng)基初始糖質(zhì)量濃度（C）3個對產(chǎn)酯影響顯著的因素為自變量，以總酯質(zhì)量濃度為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面試驗。試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計及其結(jié)果Table 2 Response surface design and the results

通過響應(yīng)面分析軟件（Design-Expert8.0.6）對表2中的數(shù)據(jù)進行分析，得到數(shù)學(xué)模型，并對數(shù)學(xué)模型進行方差分析，得到模型和回歸系數(shù)的顯著性，結(jié)果見表3。

對因素進行二次回歸擬合分析，建立顯著因素的擬合方程：

Y=7.74-0.32A+0.19B+0.58C-0.049AB+0.11AC-0.094BC-2.88A2-2.77B2-2.47C2

由表3可知，響應(yīng)面模型極其顯著，其模型的回歸系數(shù)為99.11%，R2adj為97.97%。說明該模型模擬度較好可以用此模型來預(yù)測該菌株的產(chǎn)酯能力。失擬項不顯著（P＞0.01），說明本試驗所得二次回歸方程能夠很好地對響應(yīng)值進行預(yù)測。在此模型中A2、B2、C2的P值均小于0.01，說明該菌株發(fā)酵過程中發(fā)酵液的初始pH、培養(yǎng)時間和發(fā)酵液的初始糖質(zhì)量濃度對產(chǎn)酯的影響是非常顯著的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.6.2 響應(yīng)曲面分析當(dāng)各因素大小從四周逐漸趨向中心點時，曲面圖呈凸起趨勢，說明相關(guān)因素交互作用越強，即菌株發(fā)酵產(chǎn)酯能力趨向最大化，說明存在最大響應(yīng)值[19]。由圖6（a）可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始糖質(zhì)量濃度一定時，pH和發(fā)酵時間的值由小變大時，曲線出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。圖6（b）、（c）也出現(xiàn)當(dāng)某一因素一定時，其余2種因素的圖像也呈先上升后下降的趨勢，說明該模型因素之間的相互作用較強，存在最大響應(yīng)值。運用軟件Design-Expert 8.0.6對結(jié)果進行分析，得到在pH為4.95，發(fā)酵時間為3.03 d，初始糖質(zhì)量濃度為6.23 g/dL時發(fā)酵液中總酯質(zhì)量濃度達到最大，為7.78 g/L?？紤]到實際情況，調(diào)整發(fā)酵時間為3 d，初始糖質(zhì)量濃度為6 g/dL進行驗證試驗。結(jié)果顯示，3次重復(fù)試驗中總酯質(zhì)量濃度均值為7.67 g/L，與理論值的誤差較小，說明優(yōu)化出的產(chǎn)酯條件可靠，具有實用價值。

圖6 響應(yīng)面三維立體圖Fig.6 Response surface（3D）diagram

3 結(jié)語

作者通過從糟醅中分離篩選得到一株產(chǎn)酯能力較好的菌株S5，在28℃、120 r/min的條件下培養(yǎng)5 d，產(chǎn)酯培養(yǎng)基中總酯質(zhì)量濃度達4.67 g/L。經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察，生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定菌株為異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對菌株S5的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得到該菌株最適發(fā)酵產(chǎn)酯條件為pH 4.95，發(fā)酵時間3 d，初始糖質(zhì)量濃度6 g/dL。在此條件下，該菌株發(fā)酵液總酯質(zhì)量濃度為7.67 g/L，與預(yù)測值7.78 g/L的相對誤差僅為1.4%，產(chǎn)酯量比未優(yōu)化之前提高了64.2%。此前王鵬昊[20]報道從工業(yè)化小曲中分離出1株異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus），該酵母總酯產(chǎn)量達4.065 g/L。綜合比較，本實驗篩選出的異常威克漢姆酵母在優(yōu)化后其發(fā)酵液總酯質(zhì)量濃度達7.67 g/L，說明該菌株產(chǎn)酯量較高，在白酒發(fā)酵時該菌株能提高酒中酯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，提升濃香型白酒的品質(zhì)。

該研究得到的產(chǎn)酯能力較好的酵母菌菌株是從實際生產(chǎn)用釀酒糟醅中分離獲得，能夠適應(yīng)生產(chǎn)環(huán)境。應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提高了該菌株的產(chǎn)酯能力，更有利于在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的應(yīng)用。雖然該研究是在實驗室條件下完成并獲得的實驗數(shù)據(jù)，與實際生產(chǎn)會有一定的差異，但考慮到該菌株本身來自生產(chǎn)所用糟醅，能夠適應(yīng)各種發(fā)酵因素對其的影響。若將其擴大培養(yǎng)投入釀酒糟醅中，對提高原酒中酯類含量以及成品酒酒質(zhì)必然會有一定的幫助。該研究中所篩選出的酵母菌株為進一步在實踐中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。