謝娟平, 靳文娟, 張佳瑩

(安康學(xué)院 醫(yī)學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心,陜西 安康 725000)

硒是動(dòng)物和人體中硒-P蛋白和抗氧化酶(谷胱甘肽過(guò)氧化物酶)的重要組成部分和活性中心，是GSH-Px中起氧化還原催化作用的僅有原子，能阻止和抑制自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，被稱為“天然解毒劑”[1-3]。適量補(bǔ)充硒有提高免疫力，延緩衰老，防癌抗癌的重要作用。維生素C是一種強(qiáng)抗氧化物質(zhì)，可抵御自由基對(duì)細(xì)胞的傷害，進(jìn)而抵御器官傷害，保護(hù)機(jī)體功能，維生素C常被用做參照物質(zhì)來(lái)評(píng)判抗氧化能力?；航鹗乔匕蜕絽^(qū)的特有超富硒植物資源資源之一，對(duì)土壤中的硒具有極強(qiáng)的富集作用，經(jīng)植物自身轉(zhuǎn)化，其全植物有機(jī)硒含量較高，是近年富硒植物研究的熱點(diǎn)之一。研究表明，來(lái)自于植物的有機(jī)硒更有利于人體吸收，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，能更好的起到防病抗病的作用[1][4～7]，但虎兒金植物有機(jī)硒在抗氧化活性方面是否與無(wú)機(jī)硒及維生素C存在差異，還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，測(cè)定與比較虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒及Vc的體外抗氧化活性具有重要的意義[8～9]。

研究采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法，以VC為對(duì)照，對(duì)虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒(硒標(biāo)準(zhǔn)溶液)及VC進(jìn)行清除DPPH 自由基的活性研究，評(píng)價(jià)其抗氧化活性，以期為虎兒金植物有機(jī)硒抗氧化能力評(píng)價(jià)及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)[11～12]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)，Sigma公司；甲醇、乙醇均為分析純，天津百世化工；BS224S型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；SY2200-T型超聲波清洗機(jī)(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司)；PF6-2非色散原子熒光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；101-2B型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；ML1.8-4型可調(diào)式電熱板(北京化玻醫(yī)療器械有限公司)；FW80型高速萬(wàn)能試樣粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)；SZ-97自動(dòng)三重水蒸餾氣(上海亞榮生化儀器廠)；硝酸，高氯酸，鹽酸，硼氫化鉀，氫氧化鉀，鐵氰化鉀，均為分析純；水為三重蒸餾水，氬氣，純度為99.99%。

虎兒金植物有機(jī)硒(本課題組自制，超富硒植物虎兒金中提取，氫化物發(fā)生--原子熒光光譜法測(cè)定其硒含量為75 mg·kg-1)；無(wú)機(jī)硒(硒單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液100.0 μg·mL-1，核工業(yè)化工研究所)，維生素C標(biāo)準(zhǔn)品(VC，上海滬峰化工有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)原理與方法

2.1 原理

DPPH (1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)法是篩選自由基清除劑的簡(jiǎn)便方法。由于DPPH自由基具有單電子，其甲醇溶液呈深紫色，在516 nm 處的強(qiáng)吸收與濃度呈線性關(guān)系。當(dāng)遇到抗氧化劑時(shí)，配對(duì)后溶液顏色變淺，吸光度變化與清除DPPH能力線性相關(guān)，可用于抗氧化能力的定量分析和判定。

2.2 方法

2.2.1 溶液配制 DPPH溶液配制：精密稱取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)約2.5 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，置于棕色容量瓶中避光保存，備用。

硒單元素溶液配制：精密取濃度為100 μg·mL-1的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，用5%鹽酸稀釋，得2.0 μg·L-1的無(wú)機(jī)硒供試品溶液。

虎兒金植物有機(jī)硒溶液配制：準(zhǔn)確稱取超富硒植物虎兒金中提取的植物有機(jī)硒樣品約3.7 mg，甲醇定容至100 mL，得濃度為2.775 ×10-6mg·mL-1的植物有機(jī)硒溶液。

維生素C(抗壞血酸)溶液配制：精密稱取維生素C(抗壞血酸)約2.5 mg，甲醇溶解并定容至100 m，得濃度為0.025 mg·mL-1的VC溶液，備用。

2.2.2 DPPH自由基的清除實(shí)驗(yàn) 分別吸取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL濃度為2.0 μg·L-1無(wú)機(jī)硒溶液，置于10 mL離心管中，各管依次加入0.025 mg·mL-1DPPH甲醇溶液4 mL，甲醇定容至5 mL，室溫下靜置1小時(shí)，516 nm處測(cè)定吸光度，同法做空白對(duì)照。上述操作均于避光條件進(jìn)行。按以下公式計(jì)算清除率：

式中A0為DPPH空白溶液的吸光度；At為t時(shí)刻溶液中DPPH自由基吸光度。

2.3 半數(shù)有效濃度EC50和清除能力

根據(jù)虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒及Vc清除DPPH 自由基曲線計(jì)算EC50，得到清除50% DPPH 自由基時(shí)各樣品與DPPH 的質(zhì)量之比(mg·mg-1)，EC50值越小，清除自由基能力越強(qiáng)[5]，由EC50值大小對(duì)各樣品抗氧化能力大小進(jìn)行判斷與比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 DPPH自由基清除率

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C對(duì)DPPH自由基的清除率，以樣品與DPPH的質(zhì)量比(mg·mg-1)為橫坐標(biāo)，以對(duì)DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2和圖3。

從圖1、圖2 和圖3 可以看出，根據(jù)虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C對(duì)DPPH 自由基有明顯清除作用，均有較強(qiáng)的抗氧化能力，且隨著虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C樣品量的增加，對(duì)DPPH 自由基清除能力增強(qiáng)?？梢钥闯觯趯?shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著加入量的增加，清除能力起初增加迅速，但無(wú)機(jī)硒在質(zhì)量比達(dá)到1.2×10-5mg·mg-1時(shí)清除率達(dá)到最大，此后趨于穩(wěn)定；維生素C在質(zhì)量比達(dá)到1.4×10-1mg·mg-1時(shí)趨于穩(wěn)定，之后保持平衡。

3.2 自由基清除能力評(píng)價(jià)

從圖1、圖2 和圖3 的虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C對(duì)DPPH 自由基清除擬合曲線上求出EC50值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C的EC50

由圖1～3和表1可以看出，在DPPH自由基反應(yīng)體系里，虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C對(duì)DPPH 自由基清除能力有明顯的差異，虎兒金植物有機(jī)硒及無(wú)機(jī)硒的EC50值僅大約是維生素C的1/(3.57×103)，即虎兒金植物有機(jī)硒和無(wú)機(jī)硒抗氧化能力幾乎是維生素C的2.8×104倍，表明虎兒金植物有機(jī)硒可作強(qiáng)效抗氧化劑，發(fā)揮對(duì)人體健康的保護(hù)作用。

3.3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除的影響

實(shí)驗(yàn)研究了不同反應(yīng)時(shí)間下虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C對(duì)自由基清除能力的變化。分別選取0.05 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的各樣品溶液，加入2.2.2項(xiàng)下相同量的DPPH溶液，分別于5 min、10 min、30 min、60 min、90 min時(shí)測(cè)定各樣品對(duì)DPPH自由基的清除率。以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以DPPH自由基清除率為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖4～6?？梢钥闯?，反應(yīng)時(shí)間對(duì)虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C清除DPPH自由基影響很大，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，清除率逐漸增大，30 min至60 min清除率逐漸達(dá)到最大，60 min后清除率趨于穩(wěn)定。

可以看出，不同反應(yīng)時(shí)間下，虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒和維生素C對(duì)DPPH自由基清除率不同，60 min左右各物質(zhì)對(duì)DPPH清除率最大，其中虎兒金植物有機(jī)硒和VC對(duì)DPPH清除率最大可達(dá)95.72%，無(wú)機(jī)硒對(duì)DPPH自由基清除率最大達(dá)93.42%，之后趨于穩(wěn)定。

4 討論

筆者研究采用DPPH法測(cè)定了虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒及維生素C對(duì) DPPH自由基清除能力及反應(yīng)時(shí)間對(duì)清除能力的影響。結(jié)果表明，虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒及維生素C均具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力，且隨著各物質(zhì)加入量的增加而增強(qiáng)，最終趨于穩(wěn)定。從EC50值來(lái)看，虎兒金植物有機(jī)硒、無(wú)機(jī)硒對(duì)自由基清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于維生素C。

可以看出，虎兒金植物有機(jī)硒的抗氧化能力更強(qiáng)于無(wú)機(jī)硒，但有機(jī)硒因來(lái)源于植物，經(jīng)植物自身成長(zhǎng)過(guò)程中的轉(zhuǎn)化，更有利于人體吸收，可望在抗氧化、清除有害自由基保護(hù)人體健康方面發(fā)揮更大的作用，實(shí)驗(yàn)探索結(jié)果可對(duì)虎兒金植物有機(jī)硒開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供一定參考。