杜天舒，朱澍，閆昭，張大偉，曹曉瑞

(空軍軍醫(yī)大學西京骨科醫(yī)院關節(jié)外科，陜西 西安 710032)

破骨細胞(osteoclast，OC)被認為是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細胞類型，在骨代謝平衡中扮演著重要作用。破骨細胞過度活躍可導致多種骨疾病，如骨質(zhì)疏松、關節(jié)假體松動、類風濕性關節(jié)炎、骨腫瘤、骨折后骨愈合延遲、Paget骨病等[1]，因此對破骨細胞生成和功能影響的研究一直是領域內(nèi)的熱點重點。而破骨細胞體外培養(yǎng)中分離和純化卻長期困擾著研究者?，F(xiàn)體外培養(yǎng)破骨細胞多利用原代細胞及單核/巨噬細胞Raw 264.7。相比細胞系，利用原代細胞誘導來反映破骨細胞活性有一定優(yōu)勢，但其體外誘導破骨細胞始終效果不佳，文獻報道的誘導方法也不盡相同，無法有效套用。本研究通過研究純化前后C57BL/6小鼠原代骨髓細胞向破骨細胞體外誘導的條件特點，總結(jié)利用原代細胞誘導技巧，提高誘導效率，為其體外研究提供方法學基礎。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 8周齡SPF級C57BL/6雄性小鼠10只，由空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，體重在(20±2)g之間，健康狀況良好。

1.2 試劑與材料 α-MEM培養(yǎng)基，青霉素/鏈霉素、紅細胞裂解液(美國HyClone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；小鼠骨髓單核細胞分離液試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；抗小鼠CD11b熒光抗體(美國BD公司)；牛血清蛋白(bull serum albumin，BSA)(德國Bioforxx公司)；小鼠重組M-CSF(美國PeproTech公司)；小鼠重組RANKL(美國R&D systems公司)；TRAP染色試劑盒(美國Sigma公司)；TRAP活性檢測盒(南京建成生物工程研究所)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction，q-PCR)引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3 實驗儀器 流式細胞分析儀(美國BD公司)；顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠骨髓來源原代細胞獲取 脫頸處死小鼠，無菌條件下取股骨及脛骨，剔除骨質(zhì)周圍軟組織，用含1%青霉素/鏈霉素的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗，剪除兩側(cè)干骺端，5 mL無菌注射器抽取無血清α-MEM培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，直到髓腔內(nèi)呈白色。1 000 rpm離心5 min，棄上清，加入紅細胞裂解液，將細胞吹打混勻，37℃裂解10 min，再次1 000 rpm離心5 min，棄上清后用含10% FBS，1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸骨髓細胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、體積分數(shù)5% CO2培育箱靜置培養(yǎng)。

1.4.2 小鼠骨髓單核/巨噬細胞獲取 收集過夜后骨髓原代細胞中未貼壁細胞，視為骨髓源性單核/巨噬細胞(bone marrow monocytes，BMMs)，即破骨細胞前體細胞。1 000 rpm離心5 min，用無血清α-MEM培養(yǎng)基重懸細胞3次，離心后再用含10 %FBS，1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸細胞，鏡下計數(shù)，分別以ρ=5×105cells/cm2及ρ=2.5×105cells/cm2接種于96孔板及6 cm皿內(nèi)。

1.4.3 小鼠骨髓單核/巨噬細胞分離純化 利用1.4.1中骨髓原代細胞按照小鼠骨髓單核細胞分離液試劑盒說明分離純化出BMMs，以ρ=2.5×105cells/cm2接種于96孔板及6 cm皿內(nèi)。

1.4.4 小鼠骨髓單核細胞表面抗原鑒定 將1.4.2及1.4.3中BMMs計數(shù)后取至少106個細胞收集于四個EP管(1、2、3、4管)中，離心后去除培養(yǎng)基。1管及3管分別加入1% BSA 100 μL冰上封閉30 min，作為陰性對照。2管及4管加入0.5 μL抗小鼠CD11b熒光抗體，避光冰上靜置30 min。四管離心后分別加入PBS清洗，再加入適量多聚甲醛，轉(zhuǎn)移至流式管后上機檢測。

1.4.5 破骨細胞誘導分化 將1.4.2中鋪板細胞設為4組(A、B、C、D組)，A、B組細胞鋪板ρ=5×105cells/cm2，其中A組于細胞鋪板后即刻向96孔板及6 cm皿中加入20 ng/mL M-CSF及50 ng/mL RANKL，每2天換液，待第7天收樣，96孔板內(nèi)細胞行TRAP染色，6 cm皿中細胞提取mRNA行q-PCR檢測。B組于細胞鋪板后先用20 ng/mL M-CSF預處理3 d后，再一并加入50 ng/mL RANKL，之后每2天換液，待第7天收樣，96孔板內(nèi)細胞行TRAP染色，6 cm皿中細胞提取mRNA行q-PCR檢測。C、D組細胞接種密度ρ=2.5×105cells/cm2，誘導因子M-CSF及RANKL的加入方法分別同A、B組。將1.2.3中鋪板細胞設為E、F組，誘導因子M-CSF及RANKL的使用及誘導7 d后細胞收樣方式分別同A、B組。

1.4.6 破骨細胞TRAP染色 根據(jù)TRAP染色試劑盒說明對A～F組96孔板中細胞行TRAP染色，核≥3個的TRAP陽性細胞視為成熟破骨細胞。

1.4.7 破骨細胞TRAP活性檢測 根據(jù)TRAP活性試劑盒說明對A～F組6 cm皿中的細胞上清行TRAP活性檢測。

1.4.8 破骨細胞標志性基因的q-PCR檢測 將提取出的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA(cDNA)，q-PCR檢測破骨細胞標志性基因TRAP、組織蛋白酶(cathepsin K，CTSK)、活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1)、c-Fos的表達水平。目的基因引物序列見表1。

表1 q-PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 流式細胞分析結(jié)果 未純化前小鼠骨髓原代細胞中CD11b陽性細胞比例約為(6±2)%，純化后CD11b陽性細胞比例約為(58±3)%，提示利用單核細胞分離液純化骨髓原代細胞后，其中單核細胞比例明顯增高(見圖1)。

a 未純化前骨髓原代細胞 b 純化后原代細胞

2.2 TRAP染色結(jié)果及定量分析 在M-CSF及RANKL的刺激下，細胞誘導第7天，各組細胞經(jīng)TRAP染色結(jié)果各不相同。各組破骨細胞數(shù)量比較，B、C、D組幾乎沒有TRAP陽性細胞出現(xiàn)[B組(3.30±0.67)個/孔，C組(5.67±0.87)個/孔，D組(4.00±0.58)個/孔]，提示無破骨細胞誘導生成。反之，與B、C、D組相比，A、E、F組中明顯可見數(shù)量不一的TRAP陽性細胞[A組(257.30±8.35)個/孔，E組(285.70±7.62)個/孔，F(xiàn)組(373.00±19.56)個/孔]。鏡下細胞多呈類圓形或不規(guī)則形，胞漿內(nèi)酒紅色TRAP陽性顆粒均勻沉淀，體積明顯較單核細胞大數(shù)倍，可達50～100 μm，多核(核≥3個)，周邊可見偽足伸展，胞內(nèi)可見囊泡。其中F組中TRAP陽性多核細胞數(shù)量及面積較其他組更明顯(見圖2～3)。

2.3 TRAP活性結(jié)果 將細胞誘導7 d后收集各組培養(yǎng)上清行TRAP活性檢測，結(jié)果相比B、C、D三組[B組(10.00±1.16)U/L，C組(9.00±1.14)U/L，D組(6.67±1.45)U/L]，A、E、F組的細胞上清中TRAP活性明顯增高[(24.33±2.33)U/L，(28.67±2.03)U/L，(38.37±2.01)U/L)]，差異有統(tǒng)計學意義(見圖4)，提示同TRAP染色結(jié)果相一致，A、E、F組中明顯有大量破骨細胞生成。

2.4 q-PCR結(jié)果 相比B、C、D組，A、E、F組中破骨細胞分化相關標志性基因TRAP、CTSK、NFATc1及c-Fos的表達水平明顯增高(見表2，見圖5)，差異有統(tǒng)計學意義，提示在A、E、F組中有大量BMMs分化成為破骨細胞。

3 討 論

破骨細胞被認為是體內(nèi)唯一具有骨吸收能力的細胞，其活性大小關系到整個機體的骨性質(zhì)量[2]。破骨細胞活性過小可導致骨硬化病，而活性過大則會引起骨質(zhì)疏松、骨折后骨愈合延遲、關節(jié)假體松動、骨壞死等骨質(zhì)減少疾病[3]，從而嚴重影響患者生活質(zhì)量，因此研究者對影響破骨細胞活性(包括分化或功能)的研究從未停滯過。破骨細胞體外培養(yǎng)是研究破骨細胞活性的基礎，但也是困擾研究者的難題。破骨細胞來源于造血干細胞譜系，是由多個單核/巨噬細胞融合而成，屬于高代謝終末分化細胞，具有不能傳代、生存時間短的特點[4-5]。利用原代細胞或單核/巨噬細胞RAW 264.7細胞系，通過誘導劑在體外誘導培養(yǎng)破骨細胞的誘導法，近年來被廣泛用于破骨細胞的研究。細胞系誘導出來的破骨細胞純度高，數(shù)量多，均一性好，但隨著培養(yǎng)代數(shù)增加，細胞系會出現(xiàn)細胞生理性狀丟失可能，故在體現(xiàn)細胞性狀和細胞生物學特性方面遠不及原代細胞。原代細胞擁有正常細胞形態(tài)，并且能夠體現(xiàn)出細胞在生物體內(nèi)所應具備的標記和功能，更接近生理狀態(tài)，由此獲得的數(shù)據(jù)具有更好相關性和更高價值。但利用原代細胞體外培養(yǎng)誘導分化破骨細胞往往難度較大，成功率不高，誘導質(zhì)量不佳。Guo等[6]取培養(yǎng)48 h后未貼壁骨髓原代細胞，以ρ=5×105cells/mL接種，加之50 ng/mLM-CSF+100 ng/mL RANKL進行破骨細胞誘導；Kim等[7]取培養(yǎng)24 h后未貼壁骨髓原代細胞，30 ng/mL M-CSF預處理3 d后，以ρ=1×104cells/孔接種于96孔板，30 ng/mL M-CSF+100 ng/mL RANKL處理4 d以獲得成熟破骨細胞；Feng等[8]用35 ng/mL M-CSF處理BMMs后以ρ=8×103cells/孔接種于96孔板，35 ng/mL M-CSF+50 ng/mL RANKL處理5～7 d；Kang等[9]在10 ng/mL M-CSF條件下培養(yǎng)骨髓原代細胞24 h后取未貼壁細胞，50 ng/mL M-CSF預處理3 d后，以ρ=1×104cells/孔接種于96孔板，30 ng/mL M-CSF+50 ng/mL RANKL處理3～5 d?？梢娢墨I中有關利用原代細胞體外誘導破骨細胞報道的方法不盡相同，單位不統(tǒng)一，難以單純套用，還需研究者根據(jù)自身細胞特點摸索出合適的誘導方法，并且當使用不同規(guī)格培養(yǎng)板/皿配合不同實驗時還需換算接種密度，費時費力且無法保證結(jié)果。因此，總結(jié)出便于研究者掌握的利用原代細胞體外誘導破骨細胞的特點和方法技巧，具有十分重要的意義和價值。

a A組 b B組

c C組 d D組

e E組 f F組

圖3 TRAP陽性多核細胞數(shù)量化比較 圖4 各組誘導7 d細胞上清TRAP活性

表2 各組破骨細胞分化相關標志性基因的表達水平

a TRAP b CTSK

c NFATc1 d c-Fos

通過查閱文獻，我們發(fā)現(xiàn)研究中關于破骨細胞體外誘導的接種密度各不相同，經(jīng)過換算范圍多集中在104 ～106 cells/cm2間，并且加入誘導劑M-CSF及RANKL的濃度及時機也不盡相同[6-10]。故我們按照不同接種密度(5×105cells/cm2和2.5×105cells/cm2)及誘導因子刺激方式(鋪板時直接加入M-CSF和RANKL，和先加入M-CSF預刺激3 d后再一并加入RANKL)設計A～D四組實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單純利用過夜貼壁法收集得來的BMMs，用較低密度接種(ρ=2.5×105cells/cm2)，M-CSF & RANKL共刺激法和M-CSF預刺激法這兩種方式均無法成功誘導出成熟破骨細胞(C、D組)，當提高接種密度后(如ρ=5×105cells/cm2)，相比M-CSF預刺激法，共刺激法可使BMMs成功分化為成熟破骨細胞。單核細胞純度對于破骨細胞體外培養(yǎng)十分重要。通過測定，我們發(fā)現(xiàn)過夜后直接收集的細胞懸浮液中單核細胞純度約為6%，細胞接種密度過低，細胞間距過大，故M-CSF和RANKL無法起到誘導作用，破骨細胞無法融合形成。加大細胞接種密度以增加單位內(nèi)單核細胞數(shù)量，通過刺激單核/巨噬細胞可融合分化成破骨細胞。但不同于董偉[11]的研究，細胞經(jīng)過M-CSF預刺激后再接受M-CSF和RANKL共刺激，仍沒有形成破骨細胞。M-CSF可促進單核細胞向巨噬細胞和破骨細胞分化，RANKL是破骨細胞分化過程中不可缺少的誘導因子[12-13]。我們認為在單核細胞總數(shù)較少并伴有其他細胞(如淋巴細胞、內(nèi)皮細胞等)混雜情況下，M-CSF會促使單核細胞貼壁并向成熟巨噬細胞方向分化，而后者幾乎喪失再融合分化成破骨細胞能力，故導致M-CSF預刺激組培養(yǎng)效果不佳(B組)[14-15]。RANKL的早期加入不僅可以協(xié)同增加M-CSF促細胞增殖及存活能力，而且還能促使單核細胞向未成熟巨噬細胞方向分化，并進一步分化為破骨細胞(A組)[16-17]。當我們通過分離液純化骨髓原代細胞，提高單核細胞純度(E、F組)后發(fā)現(xiàn)，即使以較低密度鋪板時，無論是何種誘導方式都能成功誘導出破骨細胞，且預刺激組誘導效果更佳。

綜上所述，本實驗通過對骨髓原代細胞的處理，BMMs接種密度以及誘導方式這幾個方面進行探索研究，總結(jié)利用原代細胞體外誘導破骨細胞的一般特點，認為當細胞懸浮液中單核細胞比例不高時，應加大細胞接種密度以提高單核細胞數(shù)量，并在M-CSF刺激下盡早加入RANKL，促進單核細胞向破骨細胞分化；當保證單位內(nèi)單核細胞數(shù)量前體下，可適當降低細胞接種密度以減少細胞間接觸抑制影響，并可利用M-CSF預處理后再行與RANKL共誘導，從而提高破骨細胞數(shù)量和質(zhì)量，為下一步體外研究破骨細胞特點打下基礎。