羅影 左中夫 張俏 薛坤 劉暢 閔連秋

近年來(lái)，糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)發(fā)病率逐年增高，一旦防治不當(dāng)，患者可出現(xiàn)視力喪失[1]。高血糖癥會(huì)觸發(fā)一系列的不良反應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[2]。Müller細(xì)胞為視網(wǎng)膜中最主要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)維持視網(wǎng)膜正常功能尤為重要[3]。DR狀態(tài)下會(huì)引起Müller細(xì)胞損傷，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞外谷氨酸含量異常增加，從而激活谷氨酸受體，對(duì)視網(wǎng)膜造成毒性反應(yīng)[4]。葛花總黃酮(total flavonoids of pueraria，TFP)為中藥葛花的提取物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其能降低血糖濃度并發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激功能[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道，TFP可有效降低1型糖尿病小鼠血糖濃度及清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基，進(jìn)而緩解糖尿病導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，TFP能降低血糖濃度并能對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善1型糖尿病大鼠腎臟損傷。但TFP對(duì)1型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的影響尚不清楚。本研究探討TFP對(duì)DR狀態(tài)下Müller細(xì)胞的影響及相關(guān)機(jī)制，為DR防治尋找新的藥物提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備取SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量為180～220 g [購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)，編號(hào)：SCXK(遼)2009-2017]。采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(55 mg·kg-1)制作大鼠糖尿病模型，72 h后檢測(cè)血糖濃度，將血糖濃度>16.7 mmol·L-1的大鼠作為動(dòng)物模型。將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分成糖尿病組、TFP組及TFP+Brusatol組(Brusatol為核因子NF-E2相關(guān)因子信號(hào)通路抑制劑)，每組15只。另取15只正常大鼠作為對(duì)照組。依據(jù)文獻(xiàn)[6]及預(yù)實(shí)驗(yàn)，TFP組給予TFP 200 mg·kg-1灌胃治療，TFP+Brusatol組在TFP組基礎(chǔ)上給予10 μL Brusatol(0.2 mg·L-1)玻璃體內(nèi)注射給藥(雙側(cè)眼球均給藥)[7]。實(shí)驗(yàn)期間檢測(cè)大鼠血糖濃度、體質(zhì)量變化。12周后，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)，TFP(錦州醫(yī)科大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，純度大于85%)，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗(兔抗大鼠)、谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)一抗(兔抗大鼠)、細(xì)胞保護(hù)因子Nrf2一抗(兔抗大鼠)、血紅素氧合酶-1(HO-1)一抗(小鼠抗大鼠)(英國(guó)Abcam公司)，谷氨酸試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量試劑盒(北京索萊寶公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，石蠟切片機(jī)(德國(guó)SLEE公司)，水平電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣本制備及一般指標(biāo)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)大鼠空腹血糖、體質(zhì)量。12周后，每組取5只大鼠，用40 g·L-1多聚甲醛固定后取出大鼠眼球進(jìn)行石蠟包埋、切片，用于免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色。每組取5只大鼠視網(wǎng)膜，制備上清，-20 ℃保存，用于Western blot檢測(cè)。另外，每組取5只大鼠視網(wǎng)膜制成100 g·L-1勻漿液，-20 ℃保存，用于MDA含量、SOD活性及谷氨酸含量檢測(cè)，三者均采用試劑盒檢測(cè)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)經(jīng)1.2.1制備的切片脫蠟后用PBS洗3次；取體積分?jǐn)?shù)3%H2O2在室溫條件下處理切片12 min，用PBS洗3次，每次3 min，隨后采用體積分?jǐn)?shù)3%山羊血清室溫孵育30 min，不洗，滴加GFAP(1300)，4 ℃過(guò)夜；用PBS洗3次，每次3 min，滴加二抗，置室溫30 min；用PBS洗3次，每次3 min，滴加SABC試劑，置室溫30 min；用PBS洗3次，每次3 min，DAB顯色，復(fù)染、脫水、透明封片后拍照；應(yīng)用Image J軟件分析GFAP表達(dá)陽(yáng)性率。

1.2.3 免疫熒光染色檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜Nrf2蛋白表達(dá)經(jīng)1.2.1制備的切片脫蠟后用PBS洗3次，每次3 min；再用體積分?jǐn)?shù)3%山羊血清+Triton X-100室溫孵育30 min，不洗，滴加Nrf2(1500)，4 ℃過(guò)夜；用PBS洗3次，每次3 min，滴加熒光二抗，置室溫1 h；用PBS洗3次，每次3 min，封片后顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4 Western blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1及GS蛋白相對(duì)表達(dá)量BCA法測(cè)定蛋白含量，電泳時(shí)加入15 μL樣品；經(jīng)120 V電壓電泳后，轉(zhuǎn)膜，用血清白蛋白封閉2 h；加入一抗(Nrf2，16000；HO-1，180 000；GS，110 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗4次，每次5 min；加入二抗室溫下孵育2 h，TBST洗4次，每次5 min；ECL顯影，以β-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析灰度值，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖濃度的變化各組大鼠造模前體質(zhì)量和血糖濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模12周后， 糖尿病組大鼠血糖濃度高于對(duì)照組，且均大于16.7 mmol·L-1；TFP組及TFP+Brusatol組血糖濃度均低于糖尿病組(均為P<0.05)；糖尿病組、TFP組及TFP+Brusatol組大鼠體質(zhì)量均低于對(duì)照組(均為P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 造模前后各組大鼠血糖濃度和體質(zhì)量

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸和MDA含量以及SOD活性檢測(cè)結(jié)果糖尿病組和TFP+Brusatol組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸含量均高于對(duì)照組(均為P<0.05)；TFP組谷氨酸含量低于糖尿病組(P<0.05)。糖尿病組和TFP+Brusatol組MDA含量均高于對(duì)照組，SOD活性均低于對(duì)照組(均為P<0.05)。TFP組MDA含量低于糖尿病組，SOD活性高于糖尿病組(P<0.05)(見(jiàn)表2)。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜谷氨酸和MDA含量及SOD活性

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜GFAP 和Nrf2蛋白表達(dá)情況糖尿病組和TFP+Brusatol組大鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(均為P<0.05)；TFP組GFAP蛋白表達(dá)陽(yáng)性率低于糖尿病組(P<0.05)(見(jiàn)圖1和表3)。將對(duì)照組Nrf2蛋白免疫熒光強(qiáng)度設(shè)定為100.00%，糖尿病組Nrf2蛋白免疫熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組(P<0.05)。TFP組Nrf2蛋白免疫熒光強(qiáng)度高于糖尿病組(P<0.05)，而TFP+Brusatol組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2和表3)。

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表達(dá)情況糖尿病組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，糖尿病組和TFP+Brusatol組大鼠視網(wǎng)膜HO-1和GS蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組(均為P<0.05)。TFP組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表達(dá)均高于糖尿病組(均為P<0.05)，而TFP+Brusatol組與對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖3和表3)。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)變化(×200)

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2蛋白表達(dá)變化

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜GFAP、Nrf2、HO-1及GS蛋白表達(dá)

圖3 Western blot 檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1及GS蛋白表達(dá)情況 A：對(duì)照組；B：糖尿病組；C：TFP組；D：TFP+Brusatol組

3 討論

預(yù)計(jì)到2025年，全球糖尿病患者人數(shù)將高達(dá)3億[8]。隨著病程的延長(zhǎng)，糖尿病患者發(fā)生DR的概率增高。近年來(lái)，氧化應(yīng)激與DR的關(guān)系已經(jīng)被認(rèn)可[9]。氧化應(yīng)激在DR發(fā)病中的破壞性作用已在糖尿病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中得到證實(shí)，而且研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑在一定程度上可有效緩解DR[10]。Müller細(xì)胞在DR進(jìn)程中至關(guān)重要，其損傷不僅可引起微血管病變，亦可造成神經(jīng)損傷[11]。GFAP為一種中間絲結(jié)構(gòu)蛋白，在Müller細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)后可損傷視網(wǎng)膜神經(jīng)元[12]。

隨著中醫(yī)藥的發(fā)揚(yáng)光大，天然中藥提取物在治療DR中扮演重要的角色。葛花為傳統(tǒng)中藥，又名葛條花，可清熱消渴。TFP為葛花的有效活性成分之一，可有效降低1型糖尿病小鼠血糖濃度及清除體內(nèi)過(guò)多的氧自由基，進(jìn)而緩解糖尿病所導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，具有抗氧化應(yīng)激作用的藥物褪黑素可抵抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而保護(hù)受損的Müller細(xì)胞[13]。本實(shí)驗(yàn)中，TFP可明顯降低1型糖尿病大鼠血糖濃度，同時(shí)可降低MDA含量，增加SOD活性，增加大鼠的抗氧化應(yīng)激能力，最終表現(xiàn)為視網(wǎng)膜GFAP蛋白表達(dá)降低，谷氨酸含量明顯下降，說(shuō)明TFP對(duì)1型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的損傷存在抑制作用。

Nrf2具有促進(jìn)各種抗氧化基因轉(zhuǎn)錄的作用。Nrf2可與Kelch-ECH結(jié)合蛋白1共價(jià)結(jié)合，當(dāng)氧化應(yīng)激增強(qiáng)時(shí)，結(jié)合蛋白1被氧化或共價(jià)修飾，從而引起Nrf2釋放。隨后，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核并與ARE結(jié)合，調(diào)控抗氧化基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，DR狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜Nrf2蛋白表達(dá)增加，這可能是DR時(shí)視網(wǎng)膜本身對(duì)氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，然而HO-1蛋白表達(dá)卻明顯下降，說(shuō)明DR時(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)度，消耗了機(jī)體自身所產(chǎn)生的HO-1蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，造成Müller細(xì)胞損傷。而給予TFP治療后，MDA含量降低，SOD含量增加，機(jī)體抗氧化能力增加，同時(shí)大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，提示TFP在一定程度上可以激活Nrf2蛋白的表達(dá)，上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)抗大鼠DR狀態(tài)下氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)受損的Müller細(xì)胞。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TFP對(duì)DR狀態(tài)下Müller細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制，本研究在給予TFP的基礎(chǔ)上進(jìn)一步給予大鼠玻璃體內(nèi)注射Nrf2抑制劑Brusatol，發(fā)現(xiàn)TFP的治療作用被逆轉(zhuǎn)，這進(jìn)一步提示TFP是通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路保護(hù)受損的Müller細(xì)胞。