陳開(kāi)意，何文妮，邵 波

（浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310011）

近年來(lái)，防曬化妝品的使用日益增長(zhǎng)，這使得防曬劑中的主要成分有機(jī)紫外防曬劑逐漸成為了一種新型環(huán)境污染物，其環(huán)境污染問(wèn)題在各國(guó)普遍存在[1]。有健康研究表明，部分有機(jī)紫外防曬劑對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)有干擾作用，并且會(huì)危害人體和生物體的生殖系統(tǒng)和遺傳系統(tǒng)，不利于胚胎的發(fā)育以及出生后的發(fā)育，非但如此，還會(huì)對(duì)人類身體健康造成潛在危害并對(duì)周邊生態(tài)環(huán)境造成污染[2]305。 因此，有機(jī)紫外防曬劑被大家認(rèn)定為一種新的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)[3-4]。 有機(jī)紫外防曬劑是指能夠吸收長(zhǎng)波紫外線和中波紫外線的一類有機(jī)化合物，這些紫外線會(huì)曬黑甚至?xí)駛覀兊钠つw[5]。 紫外線防曬劑的分子都包含可以吸收波長(zhǎng)小于400 nm 的紫外線的發(fā)色團(tuán)，發(fā)色團(tuán)為了實(shí)現(xiàn)紫外線屏蔽功能通過(guò)吸收紫外線并將其轉(zhuǎn)換為熱能、化學(xué)能或者其他非紫外線能。 紫外防曬劑的品種較多，在各種類型的有機(jī)紫外防曬劑中，二苯甲酮類防曬劑擁有良好的性能，價(jià)格便宜且應(yīng)用范圍廣，在紫外防曬劑中占據(jù)著重要的地位[6]。 由于有機(jī)紫外防曬劑的廣泛使用，因此在使用過(guò)程中會(huì)通過(guò)各種方式進(jìn)入環(huán)境。 另外，大多數(shù)有機(jī)紫外防曬劑都可以溶解在非極性溶劑中，殘留在環(huán)境中周期長(zhǎng)，不易被降解。 有機(jī)紫外防曬劑有2 種方式進(jìn)入環(huán)境，分為直接方式和間接方式。 其中，直接方式包括通過(guò)廢水排放防曬劑，將有機(jī)紫外防曬劑帶入水生生態(tài)系統(tǒng)中；而間接方式包括通過(guò)每天洗滌、游泳和沐浴等途徑帶入水中。它們可以滲入皮膚或通過(guò)食物鏈進(jìn)入人類身體。 Janjua 等人經(jīng)過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)紫外防曬劑二苯酮-3（BP-3）和4- 甲基芐亞甲基樟腦可以通過(guò)皮膚進(jìn)入人體內(nèi)，并計(jì)算出了人體血漿中含有的最大質(zhì)量濃度分別為0.238 mg/L 和0.018 mg/L[7]。

有研究表明，有機(jī)紫外防曬劑有較高毒性，而且有機(jī)紫外防曬劑通常都含有不飽和鏈和苯環(huán)，導(dǎo)致其殘留在環(huán)境中難以降解，容易對(duì)環(huán)境造成持續(xù)影響。目前，有機(jī)紫外防曬劑存在于多種環(huán)境介質(zhì)中，例如大氣生態(tài)系統(tǒng)、土壤生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)等等。 Vila 等人經(jīng)過(guò)檢測(cè)得出二苯酮-4（BP-4）容易對(duì)藻類造成風(fēng)險(xiǎn)，而B(niǎo)P-3 和甲氧基肉桂酸乙基己酯（EHMC）則更容易對(duì)魚(yú)類造成危害[8]。 另外，人體內(nèi)也被不斷檢測(cè)出存在有機(jī)紫外防曬劑，證實(shí)了有機(jī)紫外防曬劑能通過(guò)食物鏈的富集最終進(jìn)入人體和動(dòng)植物體內(nèi)。 已有報(bào)道指出，有機(jī)紫外防曬劑對(duì)人體和動(dòng)物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖發(fā)育系統(tǒng)、遺傳系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等都有不同程度的不良影響。

通過(guò)對(duì)BP-4 作用于牛血清白蛋白（BSA）時(shí)的作用機(jī)理的研究，可以了解在生物體內(nèi)BSA 與BP-4 之間的結(jié)合作用，而且對(duì)于現(xiàn)在的環(huán)境狀況來(lái)說(shuō)，有機(jī)紫外防曬劑與BSA 之間的相互作用的結(jié)果可以為環(huán)境污染的治理提供參考。

血清白蛋白是一種常用的載體蛋白，它在人體內(nèi)的血液循環(huán)系統(tǒng)中起到貯存和運(yùn)輸物質(zhì)的重要作用。將BSA 作為研究對(duì)象，探究其與內(nèi)源或外源性物質(zhì)相互聯(lián)結(jié)而發(fā)生作用后的影響機(jī)理已成為生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究的重要方向。BSA 是牛血漿中含量最豐富的載體蛋白，它具備廣泛的結(jié)合能力，同時(shí)具有很強(qiáng)的內(nèi)源性熒光。 外源性化合物與蛋白質(zhì)分子相互感化會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度下降，這就說(shuō)明其發(fā)生熒光猝滅[9]。 目前熒光光譜法已成為研究某些物質(zhì)作用于血清白蛋白時(shí)的分子機(jī)理和作用程度的有效方法。 敖俊杰等人通過(guò)熒光分光光度法研究了3 種常見(jiàn)的有機(jī)紫外防曬劑與BSA 的相互作用的作用機(jī)理[2]308。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究BP-4 與BSA 相互作用來(lái)間接驗(yàn)證其對(duì)人體的影響。 本文利用熒光分光光度法來(lái)探求BP-4 與BSA 相互作用的機(jī)理，了解二者相互作用的猝滅機(jī)理。 根據(jù)測(cè)定的數(shù)據(jù)來(lái)繪制熒光光譜圖，分析結(jié)果可知BP-4 與BSA 相互作用的熒光猝滅規(guī)律以及相對(duì)應(yīng)的猝滅常數(shù)，BP-4 與BSA 互相作用的作用力類型可以通過(guò)計(jì)算分析熱力學(xué)參數(shù)來(lái)確定。這有利于讓我們了解其在人體內(nèi)的分布情況和運(yùn)輸過(guò)程，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)有機(jī)紫外防曬劑的毒性有著非常重大的意義，同時(shí)這也有助于推動(dòng)關(guān)于有機(jī)紫外防曬劑的生態(tài)毒性的研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Rf-5301pc 熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；al-204 型電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；bcd-216zdjJ 型冰箱，青島海爾有限公司；Dk-8D 型數(shù)控超級(jí)恒溫槽，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；paoifio-t-2-20 型純水機(jī)，山東博科科學(xué)儀器有限公司；phsj-4F 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)有限公司；玻璃棒、容量瓶（100 mL，250 mL）、移液管（1 mL，5 mL）、燒杯（100 mL），上海鉑勒機(jī)電設(shè)備有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料

BSA，BR 級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海如吉生物科技有限公司；BP-4，BR 級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，上海榕柏生物技術(shù)有限公司； 三（羥甲基）氨基甲烷（Tris 化學(xué)藥品），AR 級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2.1 BSA 的性質(zhì)

BSA 是一種乳白色的片狀粉末。它的相對(duì)分子質(zhì)量為104，血清蛋白是血液的主要成分，其相對(duì)分子質(zhì)量是68 000，血清蛋白包含581 個(gè)氨基酸，其中帶有的17 個(gè)二硫鍵是由35 個(gè)半胱氨酸組成，而游離巰基組成第34 個(gè)肽鏈，牛血清白蛋白能夠和多種陰、陽(yáng)離子以及小分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)結(jié)合在一起[10]。 血液中的白蛋白主要有以下幾種作用，維持滲透壓、緩沖pH、承擔(dān)載體和營(yíng)養(yǎng)作用。 在動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)中，添加白蛋白可起到載體作用和生理和機(jī)械保護(hù)作用。

1.1.2.2 BP-4 的性質(zhì)

BP-4 是一種奶白色至黃色的粉末，無(wú)氣味。 分子式是C14H12O6S，相對(duì)分子質(zhì)量是308.04，溶解度為0.65，是一種常見(jiàn)的有機(jī)紫外防曬劑，屬于水溶性化學(xué)防曬劑。 圖1 是其化學(xué)結(jié)構(gòu)式。

圖1 BP-4 化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配置

量濃度為1×10－5mol/L BSA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液體：用電子天平稱取0.068 g 的BSA，用超純水溶解在燒杯中，移入100 mL 的容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，放置于溫度為4 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

量濃度為1×10-4mol/L BP-4 標(biāo)準(zhǔn)溶液：用電子天平準(zhǔn)確稱取0.003 1 g 的BP-4，溶于少量超純水中，移入100 mL 容量瓶中，用超純水稀釋至刻度并搖勻，放置于溫度為4 ℃冰箱中進(jìn)行保存。

量濃度為0.2 mol/ L Tris-HCl 緩沖溶液：準(zhǔn)確稱取24.228 g 的Tris 藥品倒入1 L 的大燒杯中，溶于超純水中，將超純水加至約700 mL，用濃HCl 調(diào)節(jié)pH至7.40±0.05，然后移入容量瓶中，用1 000 mL 超純水定容稀釋，搖勻，放置于室溫下進(jìn)行保存。

1.2.2 熒光猝滅實(shí)驗(yàn)

在10 mL 比色管中分別加入2 mL Tris-HCl 緩沖液、5 mL 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液以及適量的BP-4標(biāo)準(zhǔn)溶液，用超純水定容并搖勻，使BP-4 的最終量濃度分別為0、0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6和8.1×10-6mol/L。 將上述溶液置于恒溫水槽中，水溫分別調(diào)節(jié)為300、305和310 K，在恒溫條件下作用0.5 h 至平衡后測(cè)定其熒光光譜。 將熒光分光光度計(jì)固定激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm，狹縫寬度設(shè)置為10 nm，然后測(cè)定在250～500 nm 范圍區(qū)間內(nèi)的發(fā)射光譜，將熒光強(qiáng)度最大時(shí)對(duì)應(yīng)的發(fā)射波長(zhǎng)記錄下來(lái)[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 BP-4 與BSA 相互作用的猝滅機(jī)理

由于蛋白質(zhì)大分子具有酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp）等小分子結(jié)構(gòu)，所以可以產(chǎn)生較強(qiáng)的內(nèi)源性熒光。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子與外源性化合物互相作用時(shí)可能會(huì)降低蛋白質(zhì)的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度。300 K 時(shí)BP-4 與BSA 相互作用產(chǎn)生的熒光光譜圖如圖2 所示。 其中從B 到J 的藥物量濃度分別為0、0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6和8.1×10-6mol/L。

圖2 300 K 時(shí)BP-4 與BSA 相互作用產(chǎn)生的熒光光譜圖

由圖2 可見(jiàn)，向BSA 中加入BP-4 后，BSA 在340 nm 附近出現(xiàn)熒光峰值。 隨著B(niǎo)P-4 濃度的不斷升高，BSA 的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地降低，這說(shuō)明BP-4作用于BSA 時(shí)有熒光猝滅作用，引起此處內(nèi)源性熒光有規(guī)律地猝滅。

在普遍情況下，我們將熒光猝滅的過(guò)程分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅2 種類型[12]。在動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程中，熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與猝滅劑分子的碰撞作用，以能量轉(zhuǎn)移的機(jī)制或電荷轉(zhuǎn)移的機(jī)制喪失其激發(fā)能而返回基態(tài)。而靜態(tài)猝滅從實(shí)質(zhì)上來(lái)說(shuō)是因?yàn)闊晒怏w和猝滅劑通過(guò)結(jié)合形成了基態(tài)復(fù)合物，這在微觀層面上會(huì)影響蛋白質(zhì)的二級(jí)構(gòu)造，從宏觀層面上影響其生理活性?？梢酝ㄟ^(guò)雙分子猝滅速率常數(shù)Kq來(lái)判斷熒光猝滅類型， 溫度會(huì)影響猝滅作用以及熒光光譜的變化。 隨著溫度的不斷上升，由于有效碰撞的離子數(shù)不斷增加引起電子遷移的過(guò)程加劇屬于動(dòng)態(tài)猝滅；反之如果猝滅常數(shù)隨溫度的不斷升高而下降，則屬于靜態(tài)猝滅。 這是由于復(fù)合物的穩(wěn)定性隨著溫度的變化而變化。 為了更加深入地證實(shí)此猝滅過(guò)程的種類，先把它當(dāng)作動(dòng)態(tài)猝滅來(lái)處理，借助斯特恩-沃爾默方程[見(jiàn)式（1）]進(jìn)行計(jì)算[13]：

其中，F(xiàn)0和F 分別是不存在BP-4 時(shí)的熒光強(qiáng)度和存在不同濃度BP-4 后的熒光強(qiáng)度；Kq是雙分子猝滅速率常數(shù)，單位為L(zhǎng)/（mol·s）；τ0是不存在猝滅劑時(shí)熒光分子平均壽命，單位為s，通常生物大分子的熒光壽命為10-8s；[Q]為BP-4 的量濃度，mol/L；KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)。 以F0/F 對(duì)[Q]進(jìn)行建模，可以得到線性回歸方程，計(jì)算出猝滅速率常數(shù)，結(jié)果如表1 所示。

表1 BP-4 與BSA 在不同溫度下相互作用的猝滅常數(shù)

根據(jù)表1 數(shù)據(jù)可知，猝滅常數(shù)隨著溫度的升高而減少，且Kq的數(shù)量級(jí)大大超過(guò)了生物大分子在水溶液中的最大擴(kuò)散碰撞猝滅常數(shù)1 個(gè)數(shù)量級(jí)，這表明BP-4 與BSA 相互作用產(chǎn)生了不具有熒光性的復(fù)合物，該過(guò)程屬于靜態(tài)猝滅。

2.2 BP-4 在BSA 上的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合模式分析

從2.1 的結(jié)果可知，BP-4 對(duì)BSA 的猝滅機(jī)理屬于靜態(tài)猝滅，因此BP-4 的濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系就符合Lineweaver-Burk 雙導(dǎo)數(shù)方程[14]，見(jiàn)公式（2）。

式中：n 是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；Ka是結(jié)合常數(shù)，L/mol。

通過(guò)lg（[F0-F]/F）對(duì)lg[Q]進(jìn)行擬合，得到線性回歸方程，由此可以分別計(jì)算出在不同溫度下BP-4與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2 數(shù)據(jù)可見(jiàn)，BP-4 與BSA 二者結(jié)合緊密，證明了二者之間劇烈的結(jié)合作用，且BP-4 與BSA 之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)基本為1，則表明BP-4 與BSA 之間形成1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表2 BP-4 與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及相關(guān)系數(shù)

2.3 BP-4 與BSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力

一般來(lái)說(shuō)，有機(jī)小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用時(shí)的作用力主要包括范德華力、疏水作用力和氫鍵結(jié)合力等[15-16]。 當(dāng)溫度變化范圍不大時(shí)，可近似把焓變和熵變當(dāng)做常數(shù)，根據(jù)范特霍夫方程[見(jiàn)公式（3）]來(lái)計(jì)算反應(yīng)的焓變和熵變，再由公式（4）來(lái)計(jì)算反應(yīng)的自由能變。

式 中，R 為 標(biāo) 準(zhǔn) 氣 體 常 數(shù)：8.314 J/（mol·K）；△H為反應(yīng)焓變，單位為kJ/mol；△S 為反應(yīng)熵變，單位為J/（mol·K）；T 為溫度，單位為K；ΔG 為反應(yīng)的自由能變，單位為kJ/mol。 以結(jié)合常數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，溫度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，根據(jù)方程的截距和斜率分別計(jì)算得△H、△S 及△G 值，結(jié)果見(jiàn)表3。

從熱力學(xué)基本關(guān)系式來(lái)看，在溫度和壓力一定的情況下，體系中的ΔG 決定了小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用能否自發(fā)進(jìn)行，當(dāng)ΔG＜0 時(shí)，該反應(yīng)可以自發(fā)進(jìn)行。 Ross 等人研究并總結(jié)出判斷生物大分子自身相互作用力性質(zhì)以及生物大分子與小分子物質(zhì)之間相互作用力的規(guī)律，通過(guò)比較反應(yīng)發(fā)生前后熱力學(xué)焓變?chǔ) 和熵變?chǔ) 的相對(duì)大小，可以判斷分子間相互作用力類型：如果是典型的疏水作用力，則ΔH＞0，ΔS＞0；如果是氫鍵和范德華力，則ΔH＜0，ΔS＜0；如果是靜電引力，則ΔH＜0，ΔS＞0[17]。

表3 BP-4 與BSA 相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

所得數(shù)據(jù)可知，ΔG＜0，表明BP-4 可與BSA 自發(fā)反應(yīng)；根據(jù)ΔH 和ΔS 判斷，BP-4 主要通過(guò)氫鍵和范德華力與BSA 結(jié)合[18]。

3 結(jié)論

根據(jù)分析上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，可以得出以下結(jié)論：

（1） BP-4 與BSA 相互作用使得其自身的熒光發(fā)生明顯猝滅現(xiàn)象，且這種猝滅作用隨BP-4 的濃度升高而增強(qiáng)，可得出該過(guò)程屬于靜態(tài)猝滅。

（2） BP-4 與BSA 之間的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1 左右，表明二者之間存在一種類型的結(jié)合位點(diǎn)。

（3） 經(jīng)過(guò)計(jì)算BP-4 與BSA 互相作用的熱力學(xué)參數(shù)，可以知道二者的作用過(guò)程是自發(fā)進(jìn)行的，并且BP-4與BSA 之間的相互作用力屬于氫鍵和范德華力。

目前我國(guó)有機(jī)紫外防曬劑的污染問(wèn)題日益嚴(yán)峻，人們也越來(lái)越重視對(duì)其毒理性質(zhì)的研究。本實(shí)驗(yàn)表明BP-4 能在人體中通過(guò)BSA 進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存。 目前已有有機(jī)紫外防曬劑對(duì)水生動(dòng)物魚(yú)類的內(nèi)分泌干擾的相關(guān)研究[19-20]。但是對(duì)于人體組織細(xì)胞的影響研究還很少，需要進(jìn)一步深入探索，目前的研究尚不能解釋有機(jī)紫外防曬劑和內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的干擾效應(yīng)。 所以，在未來(lái)的研究?jī)?nèi)容中，我們應(yīng)該更加進(jìn)一步去研究有機(jī)紫外防曬劑產(chǎn)生的不同內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的機(jī)理。 這樣才能讓我們更加完整科學(xué)地認(rèn)識(shí)有機(jī)紫外防曬劑對(duì)不同生物包括人體健康的各種危害。 這不僅讓我們進(jìn)一步了解在平時(shí)日常生活中如何正確運(yùn)用防曬劑這類個(gè)人護(hù)理用品，與此同時(shí)也可以為相關(guān)部門(mén)提供數(shù)據(jù)方便科學(xué)決策。