劉睿琦 ，鄒安東，吳光亮,2，王鵬,2，李才敬,2，張翔宇,2，程琴,2，王燕寧,2，黃詩穎,2，賀浩華,2,3，邊建民,2,3

（1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；2江西省水稻高水平工程研究中心，南昌 330045；3江西農(nóng)業(yè)大學(xué)/作物生理生態(tài)與遺傳育種江西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045）

0 引言

水稻是世界重要的糧食作物之一，水稻高產(chǎn)與穩(wěn)產(chǎn)對(duì)于保障世界糧食安全具有重要作用[1]。水稻起源于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種喜溫作物，對(duì)低溫較為敏感。低溫冷害是水稻生長的主要限制因子之一，是世界上水稻主產(chǎn)區(qū)普遍面臨的問題。長期低溫脅迫會(huì)導(dǎo)致水稻出現(xiàn)死苗、減產(chǎn)及品質(zhì)下降等現(xiàn)象，對(duì)水稻安全生產(chǎn)造成了嚴(yán)重威脅[2-3]。根據(jù)冷害發(fā)生的時(shí)期，可將水稻冷害主要?jiǎng)澐譃檠科诶浜Α⒚缙诶浜?、孕穗期冷害、開花期冷害和灌漿期冷害[4]。其中，芽期冷害是指水稻從播種至第一片完全葉期間受到低溫影響，導(dǎo)致出芽時(shí)間延長或爛種，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。這個(gè)時(shí)期又可分為發(fā)芽期和芽期，發(fā)芽期耐冷性是水稻種子在低溫下的萌發(fā)能力，而芽期耐冷性是指水稻種子萌發(fā)后，在低溫下長成綠苗的能力[5]。芽期耐冷性是水稻生長早期重要抗逆指標(biāo)之一，水稻芽期耐冷性強(qiáng)弱，不僅決定著水稻能否在生長前期早生快發(fā)，而且對(duì)水稻后期生長起著較為關(guān)鍵的作用[6-7]。因此，尋找水稻芽期耐冷性QTL，對(duì)于解析水稻耐冷分子遺傳基礎(chǔ)、培育耐冷水稻品種具有重要作用。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，水稻耐冷性QTL 定位研究逐漸增多。利用不同水稻遺傳群體和不同耐冷性鑒定方法，定位了多個(gè)耐冷相關(guān)的QTL。其中，以種子發(fā)芽率或成苗率作為鑒定指標(biāo)，定位了至少99 個(gè)芽期耐冷性QTL[8]。Miura 等[9]利用‘Nipponbare’/‘Kasalath’回交構(gòu)建的回交自交系(BIL)群體，檢測到5個(gè)芽期耐低溫QTL，貢獻(xiàn)率均達(dá)到10%以上。Zhang等[10]和陳瑋等[11]利用‘Lemont’/‘特青’構(gòu)建的RILs群體，通過卷紙法將芽期耐冷的QTL定位在第1、3、7、11 染色體上，其中LOD 值最大的QTL 位于11號(hào)染色體，命名為qSCT-11，可用于水稻芽期耐冷性遺傳改良。Baruah 等[12]利用RILs 群體把粳稻‘Hokkaido’芽期耐冷性QTL定位在第1、5、11和12等染色體。張露霞等[13]以‘Asominori’/‘IR24’構(gòu)建的RILs群體和染色體片段置換系為材料，以芽期死苗率為耐冷性評(píng)價(jià)指標(biāo)，檢測到3個(gè)芽期耐冷性QTL，分別命名為qCTBP-5-1、qCTBP-5-2和qCTBP-12，且芽期耐冷等位基因均來自于粳型耐冷親本‘Asominori’。朱金燕等[14]以‘陸矮4 號(hào)’為受體親本、‘日本晴’供體親本的單片段代換系(SSSLs)為材料，共檢測到8個(gè)芽期耐冷QTL，分布在水稻第1、6、8、9 和10 號(hào)染色體。Zhao等[15]以‘東鄉(xiāng)野生稻’為供體構(gòu)建的159個(gè)片段代換系(CSSLs)為材料，檢測到7個(gè)耐冷性QTL，并鑒定1株極耐寒株系‘SIL157’。隨著研究的深入，QTL間的上位性研究逐漸增多，研究表明上位性效應(yīng)在水稻耐冷遺傳中也起著重要作用[16]。楊洛淼等[17]利用以粳稻品種‘東農(nóng)422’為母本，耐冷品種‘空育131’為父本，衍生構(gòu)建的190個(gè)F6和F7株系為試驗(yàn)材料，對(duì)水稻發(fā)芽期、芽期、苗期和孕穗期進(jìn)行了耐冷鑒定，共檢測到33對(duì)上位性QTL，其中12對(duì)上位性效應(yīng)為負(fù)，22對(duì)表現(xiàn)為正，貢獻(xiàn)率介于0.41%～13.54%之間，其中有11 對(duì)有加性QTL 參與互作。曲婷婷等[18]以水稻秈粳交（‘圭630’/‘02428’）構(gòu)建的加倍單倍體(DH)群體為材料，檢測到8 個(gè)控制水稻苗期耐冷性的上位性互作位點(diǎn)，分布在水稻第2、7、8、9和11染色體。Zhang等[10]利用秈粳交（‘Lemont’/‘特青’）構(gòu)建的包含269 個(gè)家系的RILs群體為材料，檢測到9個(gè)上位性互作位點(diǎn)，每個(gè)上位性位點(diǎn)對(duì)水稻幼苗耐冷性的影響都很小，但所有互作位點(diǎn)絕對(duì)上位效應(yīng)總和達(dá)36%，說明上位效應(yīng)在幼苗耐冷性遺傳控制中的重要性。

然而，水稻耐冷性是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，傳統(tǒng)水稻芽期耐冷性QTL定位多采用秈粳交后代群體，定位的芽期耐冷QTL等位基因較多來自粳型品種。由于遺傳分化差異，粳稻耐冷QTL很難在短期內(nèi)通過分子標(biāo)記技術(shù)轉(zhuǎn)育到秈稻中，來提高秈稻耐冷性，在很大程度上限制了秈稻耐冷性分子育種。因此，挖掘秈稻中耐冷QTL（基因），對(duì)于利用分子標(biāo)記技術(shù)改良秈稻耐冷性有重要作用?；诖耍狙芯坷秒p季稻區(qū)種植較為廣泛的超級(jí)稻品種‘五豐優(yōu)T025’雙親‘五豐B’和‘昌恢T025’為材料，構(gòu)建了包含124 個(gè)家系的RILs 群體，并對(duì)水稻芽期耐冷性進(jìn)行QTL 分析，以期挖掘其中芽期耐冷QTL，為秈稻特別是雙季稻秈稻芽期耐冷性育種提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘五豐優(yōu)T025’是長江中下游種植比較廣泛的超級(jí)雜交晚稻品種[19]。本研究以‘五豐優(yōu)T025’的雙親‘五豐B’和‘昌恢T025’為材料，構(gòu)建了包含124 個(gè)家系的RILs群體。

1.2 基因分型和遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

提取‘五豐B’、‘昌恢T025’和124 個(gè)家系的基因組DNA，利用物理法斷裂DNA 并構(gòu)建～300 bp 的文庫；利用華大基因MGISEQ-2000設(shè)備對(duì)構(gòu)建的文庫進(jìn)行測序；基于測序結(jié)果對(duì)其中表現(xiàn)多態(tài)性標(biāo)記的SNP進(jìn)行篩選；將連續(xù)多個(gè)SNP標(biāo)記且具有相同的基因型概括為一個(gè)bin 標(biāo)記[20]；最后利用獲得的bin 標(biāo)記結(jié)合JoinMap 4.2 軟件構(gòu)建了‘五豐B’和‘昌恢T025’雜交衍生的RILs群體高密度連鎖圖譜。

1.3 芽期耐冷性鑒定

從親本和RILs 群體每個(gè)家系中各挑選籽粒飽滿完整且無病蟲害的種子40粒，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中，加少量水于25℃下浸種1～2天，然后挑選長勢基本相同的露白種子30 粒，加少量水，放入10℃低溫恒溫箱進(jìn)行低溫處理7 天。低溫處理結(jié)束后，從低溫恒溫箱取出，將材料放入25℃的人工氣候室恢復(fù)生長7天?；謴?fù)后第7 天后測量根數(shù)、根長和芽長及幼芽存活率?；謴?fù)期間，每天換水保證水分充足。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求其平均數(shù)進(jìn)行分析。

1.4 QTL分析

采用IciMapping V4.2 軟件對(duì)RILs 群體進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和QTL定位，LOD的閾值設(shè)為2.5，當(dāng)測定LOD值大于2.5時(shí)，則判定該區(qū)段存在一個(gè)QTL，并同時(shí)測定貢獻(xiàn)率與加性效應(yīng)。加性效應(yīng)正值表明耐冷性的等位基因來自于親本‘五豐B’，負(fù)值則表示來源于親本‘昌恢T025’；LOD的閾值為5.0 判斷是否有互作效應(yīng)，當(dāng)測定LOD值大于5.0時(shí)，則判定存在互作效應(yīng)，并同時(shí)測定貢獻(xiàn)率與上位性效應(yīng)。QTL 的命名遵循McCouch 等[21]提出的原則。用SPSS22 軟件與Microsoft Excel 2017內(nèi)置公式進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 遺傳圖譜構(gòu)建

對(duì)測序的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得高質(zhì)量的SNP 701,310 個(gè)。對(duì)獲得SNP 進(jìn)行bin 轉(zhuǎn)換，經(jīng)過嚴(yán)格篩選，最終獲得均勻分布在12條染色體上2578個(gè)bin標(biāo)記，平均每條染色體包含214.8個(gè)bin標(biāo)記。其中，標(biāo)記最少的是8號(hào)染色體，有159個(gè)bin標(biāo)記，標(biāo)記最多的是1號(hào)染色體，有303個(gè)bin標(biāo)記（表1）。進(jìn)一步利用這些bin標(biāo)記分析124個(gè)家系構(gòu)建了高密度遺傳圖譜，該圖譜總距離為1762.8 Mb（圖1）。其中，2個(gè)相鄰標(biāo)記之間的平均距離為0.70 Mb，12 號(hào)染色體的平均距離最小，為0.58 Mb，8號(hào)染色體上的平均距離最大，為0.92 Mb。

2.2 芽期耐冷性的表型分析

如表2 所示，10℃低溫處理后，‘五豐B’根長和根數(shù)顯著大于‘昌恢T025’；‘五豐B’種子芽長大于‘昌恢T025’，差異不顯著；‘昌恢T025’和‘五豐B’幼苗存活率相同，均為100%。表明在低溫脅迫下，‘五豐B’長勢要好于‘昌恢T025’。

10℃低溫處理后，RILs 群體根長、芽長、根數(shù)和存活率均表現(xiàn)出不同程度差異（表2）。RILs群體偏度及峰度均小于1，表明RILs群體根長、芽長和根數(shù)表現(xiàn)為近似連續(xù)正態(tài)分布，并存在明顯的超親分離現(xiàn)象（表2，圖2）。表明‘五豐B’和‘昌恢T025’衍生的RILs 群體在芽期10℃低溫處理后，幼芽的根長、芽長和根數(shù)這3 個(gè)性狀均表現(xiàn)出典型的數(shù)量性狀遺傳，符合QTL 定位要求。

表1 染色體標(biāo)記信息及遺傳距離信息

2.3 相關(guān)性分析

利用SPSS 22軟件對(duì)RILs群體芽期10℃冷處理后的根長、芽長、根數(shù)和存活率進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，根長和芽長在10℃低溫處理后存在極顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.39；芽長和根數(shù)在10℃低溫處理后存在極顯著的正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.23（表3）。表明該RILs 群體在10℃低溫處理后，根長和芽長，芽長和根數(shù)之間存在聯(lián)系。

2.4 水稻芽期耐冷性的加性QTL分析

采用QTL Icimapping v4.2 軟件進(jìn)行QTL 分析，共檢測到3 個(gè)控制芽期耐冷性的QTL，別是qRL1、qRL2和qBL6。其中，qRL1、qRL2控制根長，qBL6控制芽長。這些QTL 分別位于水稻第1、第2 和第6 染色體，LOD值分別為2.98、2.51和5.26，可解釋的表型變異率在8.67%～14.04%之間，3個(gè)QTL增效等位基因均來自于親本‘昌恢T025’。本研究未檢測到控制存活率和根數(shù)加性QTL（表4，圖3）。

2.5 水稻芽期耐冷上位性QTL分析

本研究共檢測出13 對(duì)水稻芽期耐冷上位性互作QTL（表5，圖4）。其中以低溫處理后水稻芽長作為耐冷鑒定指標(biāo)，檢測到第3染色體和第8染色體之間存在上位性互作，其LOD值為5.21，上位性效應(yīng)為-0.24，貢獻(xiàn)率為21.77%。以低溫處理后水稻存活率作為耐冷

表2 芽期耐冷在親本和RILs群體中的分布情況

表3 RILs群體芽期10℃低溫處理后種子性狀的相關(guān)性分析

表4 水稻芽期耐冷性的QTL定位及遺傳效應(yīng)

鑒定指標(biāo)，共檢測到12 對(duì)上位性互作QTL，LOD 值在29.84～41.24 之間，上位性效應(yīng)在0.23～0.26 之間，貢獻(xiàn)率在4.68%～4.76%之間。以低溫處理后水稻根長和根數(shù)作為水稻耐冷性鑒定指標(biāo)，未檢測到上位性互作QTL。

表5 水稻芽期耐冷性的上位性效應(yīng)位點(diǎn)

3 討論與結(jié)論

低溫冷害是影響水稻生長發(fā)育的重要因素之一。水稻芽期冷害會(huì)造成死苗或爛秧，影響水稻生長和成熟，最終導(dǎo)致水稻產(chǎn)量虧損，所以提高水稻芽期耐冷性是水稻高產(chǎn)的必然要求。從國內(nèi)外研究可知，水稻耐冷性是受多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀遺傳，利用不同的研究群體定位了多個(gè)水稻耐冷相關(guān)的QTL[8]。但是，芽期耐冷相關(guān)QTL 定位的數(shù)量相對(duì)較少[22-25]。因此，定位更多的影響水稻芽期耐冷QTL對(duì)于解析水稻芽期耐冷遺傳機(jī)理并進(jìn)行水稻分子育種具有重要作用。

本實(shí)驗(yàn)共檢測出3 個(gè)控制芽期耐冷性QTL，分別位于水稻第1、2和6染色體。通過比較發(fā)現(xiàn)，戴陸園[26]以‘昆明小白谷’與‘日本晴’構(gòu)建NILs 群體定到的生殖期耐冷QTLqRCT6b與本研究定位的qBL6（物理位置：chr6:3.9478 Mb～4.0048 Mb）位置接近。目前暫未發(fā)現(xiàn)與qRL1（物理位置：chr1:0.6751 Mb～0.742 Mb）和qRL2（物理位置：chr2:18.1933～18.3025 Mb）相同或接近的水稻耐冷QTL。這2個(gè)QTL可能是水稻芽期耐冷新位點(diǎn)，需后續(xù)進(jìn)一步深入探究，結(jié)果對(duì)于解析水稻芽期耐冷遺傳機(jī)理并進(jìn)行水稻芽期耐冷改良具有重要指導(dǎo)作用。此外，本研究未檢測到控制存活率和根數(shù)加性QTL，很可能是由于控制兩個(gè)性狀的位點(diǎn)效應(yīng)較小。

一般而言，粳稻品種芽期耐冷性普遍強(qiáng)于秈稻品種[27]，通過秈粳交分離群體，也定位了來源于粳稻品種的耐冷QTL[8]。而關(guān)于秈稻間耐冷性差異研究較少，限制了筆者對(duì)不同秈稻品種耐冷性遺傳基礎(chǔ)的了解。本實(shí)驗(yàn)以2個(gè)不同秈稻品種‘五豐B’和‘昌恢T025’進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)秈稻之間也存在耐冷性的差異，同時(shí)檢測到了3 個(gè)水稻芽期耐冷性QTL，其增效等位基因均來自冷敏型秈稻恢復(fù)系‘昌恢T025’。類似的研究結(jié)果在前人的實(shí)驗(yàn)中也有提及，如張露霞等[13]利用‘Asominori’/‘IR24’構(gòu)建的RILs和染色體片段置換系為材料，以芽期死苗率為耐冷性評(píng)價(jià)指標(biāo)，鑒定出2個(gè)來自秈稻品種‘IR24’對(duì)芽期耐冷性的增效等位基因。王棋[28]以‘瀘恢99’和‘沈農(nóng)265’雜交衍生的重組自交系為材料，以低溫條件下水稻發(fā)芽率和苗期葉片赤枯度為耐冷性鑒定指標(biāo)，檢測到的qLTG-5和qSCT-9，其耐冷增效等位基因均來源于秈稻品種‘瀘恢99’。這些結(jié)果表明秈稻中也蘊(yùn)藏著耐冷基因(QTL)，因此，挖掘秈稻耐冷基因(QTL)對(duì)于利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行耐冷基因(QTL)聚合育種提高秈稻耐冷性具有重要作用?！諸025’作為江西等雙季稻區(qū)比較有代表性的秈稻恢復(fù)系品種，可以利用‘昌恢T025’作為中間材料，進(jìn)行連鎖分子標(biāo)記，通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將這些芽期耐低溫的主效QTL轉(zhuǎn)入其他秈稻品種中，提高秈稻品種的芽期耐低溫能力。此外，盡管本研究通過構(gòu)建的高密度遺傳圖譜已將3個(gè)控制水稻芽期耐冷性的QTL定位在很小的染色體區(qū)間，但是由于重組自交系群體背景復(fù)雜，很難在短期內(nèi)將其中耐冷QTL分離克隆，因此有必要構(gòu)建近等基因系來分離并克隆這些水稻芽期耐冷性QTL，為解析秈稻耐冷遺傳機(jī)理和后期利用這些QTL 進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

上位性互作是數(shù)量性狀遺傳的重要組成部分，上位性互作對(duì)解析復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)具有十分重要的意義[29-32]。本實(shí)驗(yàn)以低溫處理后的芽長為耐冷鑒定指標(biāo)，檢測到第3染色體與第8染色體之間存在上位性互作，其貢獻(xiàn)值最大，為重組型大于親本性互作。此外，每條染色體上都檢測到一對(duì)低溫脅迫下影響水稻芽期存活率上位性互作位點(diǎn)，并且位點(diǎn)相鄰。而未檢測到與根長和根數(shù)相關(guān)的上位性互作位點(diǎn)。表明在水稻芽期，上位性互作位點(diǎn)可能在調(diào)控水稻低溫脅迫起了重要作用。關(guān)于芽期耐冷上位性效應(yīng)研究涉及較少，所以發(fā)掘上位性互作新位點(diǎn)并分析位點(diǎn)間上位性互作和估算其效應(yīng)，可以進(jìn)一步了解芽期耐冷的遺傳基礎(chǔ)及為輔助育種提供依據(jù)。

本研究以雙季超級(jí)稻品種‘五豐優(yōu)T025’雙親‘五豐B’和‘昌恢T025’雜交衍生的重組自交系群體為材料，對(duì)水稻幼芽耐冷性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示水稻芽期耐冷性是由數(shù)量性狀位點(diǎn)控制的。結(jié)合高密度連鎖圖譜，檢測到3 個(gè)控制芽期耐冷性主效QTL，其中qBL6可能與已報(bào)道的基因是同一基因或等位基因，而qRL1和qRL2所在染色體位置目前尚未有耐冷QTL的報(bào)道，可能是控制芽期耐冷的新位點(diǎn)。這些耐冷QTL 定位對(duì)于后續(xù)克隆秈稻耐冷基因解析秈稻耐冷遺傳機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。此外，本研究檢測到13對(duì)影響水稻芽期耐冷上位性互作QTL，說明上位性互作效應(yīng)在調(diào)控水稻芽期耐冷過程中起著重要作用。