許 寫，陳瑜哲，楊建生，吳正常，包文斌，吳圣龍*

（1.揚州大學動物科學與技術(shù)學院，江蘇揚州 225009；2.昆山市畜牧獸醫(yī)站，江蘇昆山 215300）

活化白細胞黏附分子（Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule，ALCAM）基因又稱為CD166，屬于免疫球蛋白超家族的成員，是淋巴細胞抗原CD6 的配基，在調(diào)節(jié)機體適應(yīng)性免疫機制中發(fā)揮重要作用[1-2]。目前，關(guān)于ALCAM基因的研究主要集中在人類醫(yī)學上[3]，人ALCAM基因表達定位于上皮細胞間連接處，作為黏附結(jié)構(gòu)之一參與維持組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并在機體適應(yīng)性免疫調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究表明[4]，ALCAM基因可與淋巴細胞抗原6（Cluster of Differentiation 6，CD6）發(fā)生異嗜性相互作用及與自身發(fā)生同嗜性相互作用來介導(dǎo)細胞間的黏附。此外，ALCAM基因在免疫突觸穩(wěn)定性、T 細胞增殖與活化、單細胞跨內(nèi)皮遷移等方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明，ALCAM基因與CD6 的結(jié)合有助于穩(wěn)定T 細胞與抗原呈遞細胞（APC）之間的連接，進而誘導(dǎo)機體發(fā)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)[1]。Nassan 等[5]阻斷ALCAM基因與CD6的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)機體T 細胞對抗原的免疫應(yīng)答減弱。孫麗等[6]研究初步鑒定ALCAM基因表達水平在仔豬大腸桿菌感染過程發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用。然而，目前關(guān)于豬ALCAM基因的序列特征、表達模式、密碼子使用偏好性以及蛋白結(jié)構(gòu)功能等方面的研究尚無報道，而生物信息學對分析與揭示某一特定基因序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及功能提供有力的分析方法[7-8]。本研究一方面通過生物信息學方法獲得豬ALCAM基因的編碼區(qū)全長序列，分析其密碼子使用模式，使用生物信息學軟件預(yù)測出其序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及功能位點，并結(jié)合生物信息學和比較基因組學對ALCAM蛋白質(zhì)進行功能分析；另一方面采用熒光定量PCR 技術(shù)對其在梅山豬不同組織中的mRNA 表達進行定量檢測，以期為今后深入探究ALCAM基因在豬抵抗病原感染過程中發(fā)揮的免疫調(diào)控機制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取來自昆山市梅山豬國家級保種場的5頭35 日齡的梅山斷奶仔豬，屠宰后，取心、肝臟、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴、十二指腸、空腸和回腸12個組織，現(xiàn)場液氮保存，然后轉(zhuǎn)移至-70℃冰箱保存。

1.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank 公布的豬ALCAM基因（登錄號：NC_010455.5）的序列設(shè)計實時熒光定量引物，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH）基因作為內(nèi)參基因，引物均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 總RNA 提取、cDNA 合成和熒光定量反應(yīng) 利用Trizol 法，嚴格按照試劑盒操作步驟提取組織總RNA，經(jīng)NanoDrop-1000 微量核酸測定儀檢測總RNA 的純度和濃度，-70℃保存?zhèn)溆?。以RNA 為模板按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進行cDNA 合成，實時熒光定量反應(yīng)體系及程序按照定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）說明進行，每個樣本進行3 次實時PCR 檢測，取平均值。

1.4 豬ALCAM基因密碼子偏好性分析 運用Condow 1.4.2 軟件以及EMBOSS 軟件包中的chip 和cusp 在線程序計算密碼子相關(guān)參數(shù)：①堿基組成及基本參數(shù)；②同義密碼子相對使用度（Relative synonymous Codon Usage，RSCU），用于衡量密碼子使用偏好性程度；③密碼子使用頻率（Frequency），運用Codon Usage Database數(shù)據(jù)庫（http://www.kazusa.or.jp/codon）篩選大腸桿菌、酵母以及鼠基因組的密碼子使用頻率。

1.5 生物信息學分析 利用生物信息學相關(guān)軟件分析豬ALCAM 蛋白的基本理化性質(zhì)、基本結(jié)構(gòu)、功能位點和區(qū)域，相關(guān)參數(shù)分析網(wǎng)址：①蛋白基本理化性質(zhì)（http://web.expasy.org/protparam/）；②蛋白質(zhì)親水性/疏水性（http://web.expasy.org/protscale/）；③信號肽預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；④跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；⑤蛋白潛在磷酸化位點預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）；⑥蛋白潛在N-糖基化位點及O-糖基化位點預(yù)測（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/，http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）；⑦蛋白互作分析（https://stringdb.org/）；⑧蛋白保守結(jié)構(gòu)功能域（http://smart.emblheidelberg.de/smart/batch.pl）。

1.6 數(shù)據(jù)分析 定量結(jié)果根據(jù)2-ΔΔCt法進行處理，用內(nèi)參基因GAPDH對不同組織中ALCAM基因的表達水平進行均一化，運用Graphpad Prism 6.0 繪制ALCAM基因在梅山豬不同組織中的表達譜。

2 結(jié)果與分析

2.1ALCAM基因組、mRNA 和蛋白結(jié)構(gòu)分析 通過NCBI 數(shù)據(jù)庫搜索ALCAM基因組DNA，發(fā)現(xiàn)該基因位于豬13 號染色體NC_010455.5 的153 794 991～153 998 241 位置，其全長203 251 bp，包含IGv（121～339）、C2-set_2（409～693）、IG_like（763～987）、IG_2（1036～1236）、Ig superfamily（1243～1464）5個功能結(jié)構(gòu)域。

2.2 豬ALCAM基因密碼子偏好性分析

2.2.1 豬ALCAM基因堿基組成及相關(guān)參數(shù)分析 豬ALCAM基因密碼子有效密碼子數(shù)（ENC）為52.65，表明豬ALCAM基因密碼子使用偏好性較強；其密碼子第三位4 種堿基中A+T 堿基含量高于G+C 含量；且CDS 區(qū)全序列的GC 含量和不同位置的GC 含量（GC1s、GC2s、GC3s）值分別為0.427、0.461、0.382、0.436，含量均小于50%，表明豬ALCAM基因密碼子使用偏好以A/U 結(jié)尾的密碼子。

2.2.2 豬ALCAM基因RSCU 值分析 豬ALCAM基因61 個密碼子的RSCU 值計算，用于衡量該基因同義密碼子使用偏移的情況，RSCU 值＞1 表明該密碼子具有偏好性，RSCU 值＞1.6 則表明密碼子的偏好性較強[9]。RSCU 值分析表明豬ALCAM基因存在28 個高頻密碼子，其中CGG、AGA、GGA、GCU、ACA 這5 個密碼子的偏好性最強，且多數(shù)以A 或U 結(jié)尾，進一步表明豬ALCAM基因偏好使用以A/U 結(jié)尾的密碼子。

2.2.3 與模式生物基因組密碼子使用頻率比較分析 如表2 所示，豬ALCAM基因與大腸桿菌基因組密碼子使用存在較大差異的有20 個，而與小鼠、酵母菌基因組存在較大差異的密碼子有17 個，這表明相較于大腸桿菌模式生物基因組，小鼠和酵母菌是更適合豬ALCAM基因的外源表達系統(tǒng)。

表2 豬ALCAM 基因與模式生物基因組密碼子使用頻率比較

注：下劃線表示2 個物種密碼子比較具有明顯偏差（≤0.5，≥2）的分值。

2.3 豬ALCAM基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能位點分析 本研究運用生物信息學相關(guān)軟件分析發(fā)現(xiàn)，ALCAM基因CDS 區(qū)全長1 713 bp，編碼570 個氨基酸，半衰期約30 h，其脂溶性指數(shù)為85.98，不穩(wěn)定指數(shù)為48.09（大于40），表明ALCAM 蛋白為不穩(wěn)定蛋白；豬ALCAM 蛋白的總平均親水系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.315，表明該蛋白為親水性蛋白。此外，豬ALCAM 蛋白存在一個跨膜區(qū)域（515～537 aa），在第1～27 位氨基酸之間存在信號肽，且在27～28 位氨基酸之間存在信號肽剪切位點；無潛在的O-糖基化位點，存在5 個N-糖基化位點，分別位于第95、167、265、337、480 位氨基酸；存在96 個磷酸化位點，包括14 種特異性蛋白激酶結(jié)合位點：PKC（27）、PKA（5）、PKG（4）、cdc2（6）、cdk5（1）、p38MAPK（1）、GSK3（2）、INSR（4）、CKII（4）、DNAPK（4）、CaM-II（1）、EGFR（1）、RSK（1）、unsp（34）。

2.4 進化分析 將豬ALCAM 單邊序列與小家鼠（Mus musculus，NM_001331110.1）、大白鼠（Rattus norvegicus，NM_031753.1）、人（Homo sapiens，NM_001243280.1）、黑猩猩（Pan troglodytes，XM_516634.7）、犬（Canis lupus familiaris，NM_001313804.1）、綿羊（Ovis aries，XM_012189447.2）和牛（Bos Taurus，NM_174238.1）等7 個物種的蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入MEGA7.0，計算相似度，分別為88.91%、86.99%、92.94%、90.70%、92.07%、92.29%、92.69%?；卩徑臃ǎ∟eighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

2.5 梅山豬ALCAM基因組織表達譜分析 由圖3 顯示，ALCAM基因在梅山豬不同組織中均有表達，其中，在肺臟、胃和淋巴組織中為較高表達水平，在肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織（十二指腸、空腸和回腸）中為中等表達水平，而在心臟、肌肉和胸腺組織中為低表達水平。

3 討 論

本研究首次通過生物信息學方法成功獲得了豬ALCAM基因的編碼區(qū)全長序列，并預(yù)測出其序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及功能位點，為今后深入研究豬ALCAM基因功能提供一定的基礎(chǔ)理論材料。對于蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點而言，蛋白質(zhì)磷酸化是翻譯過程中重要的共價修飾方式之一，其修飾過程與基因表達、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞分裂、細胞的生長周期、生長發(fā)育以及部分癌癥發(fā)病機制密切相關(guān)[10]。蛋白質(zhì)糖基化修飾主要發(fā)生在哺乳動物蛋白中，在多種疾病的早期診斷和發(fā)展進程中發(fā)揮重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)豬ALCAM 蛋白存在5 個N-糖基化位點和96 個磷酸化位點，其中包含14 個PKC特異性蛋白激酶位點，如果這些位點發(fā)生修飾后，可能會影響ALCAM基因的表達水平，這提示今后開展ALCAM 的蛋白組學研究時要重點關(guān)注以上位點的糖基化和磷酸化狀態(tài)。此外，本研究預(yù)測出豬ALCAM 蛋白存在保守功能結(jié)構(gòu)域（IGv、C2-set_2、IG_like、IG_2、Ig superfamily），這些結(jié)構(gòu)域可能與ALCAM基因免疫調(diào)控作用有關(guān)，今后需要利用基因敲除技術(shù)來進一步驗證，同時利用PCR-SSCP/RFLP 技術(shù)重點篩選與驗證位于這些功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的重要變異位點，為開展豬抗病育種有效遺傳標記的篩選提供一定的指導(dǎo)和依據(jù)。

核酸是蛋白質(zhì)合成的模板，編碼天然蛋白質(zhì)20 種基本氨基酸的密碼子共61 種，每種氨基酸可由1～6 個密碼子編碼，這些密碼子稱為同義密碼子。某一特定基因在翻譯中編碼相同氨基酸的同義密碼子（Synonymous Codon）不均一使用情況被稱為密碼子使用偏好性（Codon Usage Bias，CUB）[12]，而密碼子偏好性分析有助于理解不同物種的進化發(fā)展，還可有效幫助理解同義密碼子使用偏好性相關(guān)機制。此外，密碼子偏好性分析有助于了解某個基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的調(diào)控機制，并且對于尋找該基因最佳外源表達系統(tǒng)或宿主從而提高基因的表達水平具有重要的理論意義。因此，本研究分析了豬ALCAM基因的密碼子使用模式，發(fā)現(xiàn)偏好以A/U 結(jié)尾，CGG、AGA、GGA、GCU、ACA 為優(yōu)勢密碼子，并且小鼠是較佳外源表達動物。本研究從密碼子層面分析了豬ALCAM基因的密碼子使用模式，為今后通過密碼子改造或者外源表達調(diào)節(jié)豬ALCAM基因的表達量，進而調(diào)節(jié)其在機體適應(yīng)性免疫中的作用提供了參考依據(jù)。此外，本研究探究了ALCAM基因在梅山豬中的組織表達譜情況，發(fā)現(xiàn)其在不同組織中均有表達，特別是肺臟中呈現(xiàn)較高表達，雖然肺不是免疫器官，但其作為呼吸系統(tǒng)中的重要器官，與外界接觸較為頻繁，提示該基因可能在抵御外界惡劣環(huán)境等應(yīng)激時發(fā)揮重要作用；其次在淋巴和腸道組織中呈現(xiàn)較高表達水平，表明ALCAM基因可能在機體免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。然而其表達水平是否與豬抵抗細菌或者病毒感染有關(guān)，需要在細胞水平上對該基因進行RNA 干擾、過表達以及sgRNA-Cas9 敲除，構(gòu)建穩(wěn)定沉默或過表達ALCAM 的豬小腸上皮細胞系（IPEC-J2），在此基礎(chǔ)上一方面進行轉(zhuǎn)錄組、非編碼RNA 測序以及蛋白質(zhì)組學分析，另一方面可結(jié)合革蘭氏染色、間接免疫熒光以及定量表達檢測來評估豬ALCAM基因表達水平對細菌或者病毒感染能力的影響，進一步探討豬ALCAM基因在機體抵抗外源病原感染過程中發(fā)揮的免疫調(diào)控作用及分子機制。

4 結(jié) 論

本研究初步揭示了豬ALCAM基因序列特征、蛋白結(jié)構(gòu)與功能以及組織表達特性，發(fā)現(xiàn)豬ALCAM基因CDS 區(qū)全長序列1 713 bp，共編碼570 個氨基酸，其中存在1 個信號肽區(qū)域（1～27aa）、1 個跨膜結(jié)構(gòu)域（515～537aa）、5 個潛在的N-糖基化位點和96 個特異性蛋白激酶結(jié)合位點，二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主。豬ALCAM基因的密碼子使用偏好以A/U 結(jié)尾，28 個密碼子的使用偏好性較強（RSCU值＞1），其中5 個優(yōu)勢密碼子，分別是CGG、AGA、GGA、GCU、ACA，并且模式生物小鼠是ALCAM基因最佳外源表達動物。本研究結(jié)果為今后深入研究豬ALCAM基因的生物學功能提供一定的理論基礎(chǔ)。