樊紅蓮，閔靜婷，吳勝男，李正紅

(蚌埠醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

肺癌是癌癥死亡最常見(jiàn)的病因之一，每年約有180萬(wàn)人被診斷為肺癌，160萬(wàn)人死于肺癌[1]。非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌病例的85%，其中肺腺癌占40%，在非吸煙患者和女性中所占比例較高，約三分之一的患者在診斷初期即為肺癌晚期，根據(jù)病情階段和地區(qū)的不同，肺癌患者的5年生存率在4%～17%之間，如何有效治療肺癌，延長(zhǎng)患者生命成為人們關(guān)注的問(wèn)題[2-3]。目前臨床對(duì)于肺癌治療仍以手術(shù)治療為優(yōu)選，但是對(duì)于手術(shù)治療無(wú)法切除的病灶以及微小轉(zhuǎn)移灶，化療則成為了更好的選擇。臨床針對(duì)肺癌采用的化療藥物大多數(shù)都具有嚴(yán)重的毒副作用，在殺死患者體內(nèi)癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)患者的正常機(jī)體功能也造成了損傷。因此，尋找一種安全有效的化療藥物至關(guān)重要。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞獲取能量的方式有氧化磷酸化和無(wú)氧糖酵解兩種，氧氣充足時(shí)葡萄糖通過(guò)氧化磷酸化途徑可以產(chǎn)生32分子腺苷三磷酸(ATP)，而通過(guò)無(wú)氧糖酵解過(guò)程僅能獲得2分子ATP[4]。正常細(xì)胞獲取能量的70%都來(lái)自三羧酸循環(huán)，僅有20%來(lái)自糖酵解，而腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下獲取能量的方式也依然主要來(lái)自于糖酵解過(guò)程，產(chǎn)生能量有限，所以腫瘤細(xì)胞為保持增殖轉(zhuǎn)移等活動(dòng)會(huì)加速宿主對(duì)糖分的攝取和代謝，這一特點(diǎn)也成為了臨床研究抗腫瘤藥物的一大靶點(diǎn)[5]。

3-BP是一種小分子烷化劑，也是細(xì)胞糖酵解產(chǎn)物乳酸、丙酮酸的類似物，可以被細(xì)胞獲取從而與乳酸、丙酮酸競(jìng)爭(zhēng)阻斷糖酵解過(guò)程，抑制腫瘤細(xì)胞攝取能量以殺死腫瘤細(xì)胞。近年來(lái)，3-BP被廣泛用于抗腫瘤的臨床前研究中，對(duì)乳腺癌、肝癌、胃癌等癌癥具有明顯的抗腫瘤效果[6-8]，為了探究3-BP在針對(duì)肺腺癌治療是否也能起到好的治療效果，本實(shí)驗(yàn)選取肺腺癌H1975細(xì)胞，研究3-BP對(duì)肺腺癌H1975細(xì)胞的增殖及凋亡的作用及在此過(guò)程中的能量代謝變化，為3-BP在肺腺癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人肺腺癌細(xì)胞株H1975購(gòu)于北納生物，由蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院凍存。

1.2 藥品與試劑RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，批號(hào):C22400500BT)，胎牛血清(Gibco，批號(hào):10099141)，MTT( Biofroxx，批號(hào):3580MG250)， Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(Bestbio，批號(hào):BB-4101-3)，ATP檢測(cè)試劑盒(碧云天，批號(hào):S0026)、活性氧檢測(cè)試劑盒(碧云天，批號(hào):S0033S)， HK-Ⅱ抗體(Proteintech，批號(hào): 22029-1-AP)，PDK抗體(CST，批號(hào):3062T)， MCT-1抗體(Abcam，批號(hào):ab102678)；Bax(批號(hào):AF0120)、Bcl-2(AF0769)和β-actin(批號(hào):AF7018)抗體均購(gòu)自Affinity公司，3-BP(Sigma，批號(hào):113-59-3)。

1.3 儀器Olympus倒置顯微鏡；Bio-Tek Synergy2型多功能酶標(biāo)儀；BD流式細(xì)胞儀；上海天能化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)；上海一恒科學(xué)儀器THZ-100恒溫?fù)u床。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞株H1975培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)良好的H1975細(xì)胞接種于96孔板中，每孔6 000個(gè)細(xì)胞；待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定24 h后，向細(xì)胞中加入不同濃度的3-BP(10、20、40、80、160 μmol·L-1)處理24和48 h，設(shè)置陰性對(duì)照孔和空白孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，處理時(shí)間到后向每孔加入MTT溶液(5 g·L-1)150 μL，放入37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去上層液，向每孔加入200 μL DMSO，搖床孵育20 min后放入酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD值。細(xì)胞存活率/%=(給藥孔吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.4.3集落克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低濃度 3-BP對(duì)細(xì)胞增殖抑制能力接種對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞于六孔板中，每孔4 000～5 000個(gè)細(xì)胞，24 h細(xì)胞貼壁后將3-BP按:0、5、10、20 μmol·L-1濃度加入各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)5～7 d；待顯微鏡下觀察到細(xì)胞集落形成后，吸棄上清液，加入2～3 mL的PBS洗滌；每孔加入1～2 mL 4%多聚甲醛固定30 min，用PBS輕洗3次；吸取1～2 mL結(jié)晶紫染液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，室溫孵育15～20 min；用2～3 mL PBS清洗3次，將六孔板倒置放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)的濾紙上晾干，拍照。

1.4.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 選擇對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的肺癌細(xì)胞接種于六孔板中，6×105個(gè)/孔，向每孔補(bǔ)足培養(yǎng)基至2 mL，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；待細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)，用200 μL移液槍的槍頭垂直六孔板底部劃線，每隔0.5～1 cm劃一條，每孔劃3～4條直線并保持平行，顯微鏡下拍照記錄0 h的劃痕照片；按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組和給藥組，給藥組3-BP濃度為:25、50、75 μmol·L-1；對(duì)照組為不給藥組，按藥物濃度給予藥物，每組3個(gè)復(fù)孔，放進(jìn)37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)時(shí)間到后取出六孔板，放在顯微鏡下觀察拍照，記錄數(shù)據(jù)以備后續(xù)分析處理；采用ImageJ分析計(jì)算細(xì)胞遷移的距離。

1.4.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取生長(zhǎng)情況良好的對(duì)數(shù)期肺癌細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液；將Transwell小室放入24孔板中，上室中加入稀釋后的細(xì)胞懸液200 μL， 1×105個(gè)/孔，下室加入600 μL含15%FBS的新鮮完全培養(yǎng)基，按照實(shí)驗(yàn)分組給予藥物濃度分別為:0、25、50、75 μmol·L-1，培養(yǎng)24 h；時(shí)間到后取出Transwell小室，將上室上清液棄去，用PBS小心漂洗3遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗后用棉簽擦去上室沒(méi)有遷移的細(xì)胞，加入結(jié)晶紫染液染色15 min，去除多余的結(jié)晶紫染液，倒扣小室進(jìn)行晾干，隨機(jī)挑選5個(gè)視野進(jìn)行拍照，計(jì)算穿過(guò)膜的肺腺癌細(xì)胞的數(shù)目。

1.4.6Annexin Ⅴ/PI-FITC雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 接種H1975細(xì)胞于六孔板內(nèi)，每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后向各孔細(xì)胞內(nèi)加入不同濃度的3-BP(0、25、50、75 μmol·L-1)進(jìn)行處理24 h；吸棄上層廢液，PBS清洗后加入胰酶消化，收集消化后的細(xì)胞加入400 μL 1×Binding buffer懸浮細(xì)胞，濃度為1×106個(gè)細(xì)胞·mL-1；吸取5 μL Annexin V-FITC加入EP管中，混勻后置于4 ℃避光孵育15 min；向管內(nèi)加入PI染液10 μL，輕搖混勻后放入4 ℃ 5 min；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.4.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H1975細(xì)胞接種在6 孔板中，細(xì)胞貼壁后向各孔加入不同濃度的3-BP(0、50、100、150 μmol·L-1)處理6 h，消化收集處理后的細(xì)胞離心1 000 r·min-1，5 min，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋熒光探針DCFH-DA，稀釋比例為1 ∶1 000，稀釋后加入收集后的細(xì)胞中，每毫升可裝載1×106個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱37 ℃孵育20 min，3～5 min將試管進(jìn)行上下顛倒使細(xì)胞混勻，讓探針可以盡可能多地進(jìn)入細(xì)胞；取PBS洗滌細(xì)胞3次以洗去多余的未裝載的DCFH-DA探針，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管內(nèi)上機(jī)檢測(cè)，保留數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)處理分析。

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1.4.83-BP處理后H1975細(xì)胞內(nèi)部ATP水平測(cè)定 接種H1975細(xì)胞于6孔板中，每孔2.0×105～2.5×105個(gè)細(xì)胞，加入2 mL培養(yǎng)液等待細(xì)胞貼壁；吸棄上層液，加入相應(yīng)濃度的3-BP，陰性對(duì)照組不加入藥物，放入培養(yǎng)箱處理5 h；時(shí)間到后取出培養(yǎng)板，吸棄上清液，每孔加入200 μL ATP裂解液，置于冰上裂解；裂解后離心，4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min，吸取離心后的上清液于一新的EP管內(nèi)；取ATP檢測(cè)工作液放入黑色96孔板中，每孔100 μL，將各組待測(cè)樣品加入96孔板內(nèi)，放入多動(dòng)能酶標(biāo)儀中進(jìn)行檢測(cè)，保存結(jié)果用于后續(xù)分析。

1.4.9Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 接種H1975細(xì)胞于35mm中皿內(nèi)，細(xì)胞貼壁后加入終濃度為25、50、75 μmol·L-1的3-BP和陰性對(duì)照組處理24 h，消化收集細(xì)胞，加入100 μL細(xì)胞裂解液置于冰上裂解1 h，4 ℃離心15 min，12 000 r·min-1，收集上清液并測(cè)定濃度。40 μg蛋白上樣，電泳2 h，轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉20 min。加入一抗，4 ℃過(guò)夜，d 2取出膜，TBST洗滌，10 min/次，4次，加入二抗(1 ∶10 000)，37 ℃ 孵育60 min，60 r·min-1搖床30 min，TBST洗滌，10 min，4次，浸入顯影劑曝光，保存圖片用于后續(xù)分析。采用ImageJ測(cè)定各顯示條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin灰度值的比值為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 3-BP對(duì)H1975細(xì)胞的增殖抑制作用為觀察3-BP對(duì)H1975細(xì)胞增殖的影響，實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度的3-BP處理肺腺癌細(xì)胞24 h、48 h，MTT結(jié)果顯示，3-BP對(duì)肺腺癌H1975細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，并且隨時(shí)間和濃度的增加而增加。集落克隆結(jié)果顯示，在選用了低濃度的5、10、20 μmol·L-1的 3-BP處理后，與陰性對(duì)照組相比，3-BP給藥組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)Fig 1和Fig 2)。

2.2 3-BP對(duì)H1975細(xì)胞遷移能力的影響為觀察3-BP對(duì)H1975細(xì)胞遷移的影響，實(shí)驗(yàn)中采用不同濃度的3-BP處理H1975細(xì)胞24 h，觀察劃痕愈合率和穿孔細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果顯示，3-BP對(duì)肺腺癌H1975細(xì)胞具有遷移抑制作用，并且隨濃度的增加抑制作用更加明顯。與陰性對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)Fig 3和Fig 4)。

2.3 3-BP誘導(dǎo)肺腺癌H1975細(xì)胞凋亡AnnexinV-FITC/PI雙染檢測(cè)3-BP對(duì)H1975細(xì)胞凋亡率的影響，結(jié)果顯示，25、50、75μmol·L-1的3-BP處理后，與對(duì)照組相比，3-BP給藥組H1975細(xì)胞凋亡率明顯升高，隨著給藥濃度的增加，凋亡率也隨之上升(P<0.05，見(jiàn)Fig 5)。

Fig 1 Effect of 3-BP on cell proliferation of H1975

Fig 2 Effect of colony formation of H1975 cells by 3-BPA:Control group; B: 5 μmol·L-1 group; C: 10 μmol·L-1 group; D: 20 μmol·L-1 group；**P<0.01 vs control group

Fig 3 Scratch test results of H1975 cells with 3-BP(×100)A:Control group; B: 25 μmol·L-1 group; C: 50 μmol·L-1 group; D: 75 μmol·L-1 group.**P<0.01 vs control group.

Fig 4 Effect of 3-BP on migration of H1975 cells (×200)A:Control group; B: 25 μmol·L-1 group; C: 50 μmol·L-1 group; D: 75 μmol·L-1 group.**P<0.01 vs control group.

2.5 3-BP對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響3-BP作為糖酵解抑制劑，為了進(jìn)一步了解其作用于肺腺癌細(xì)胞過(guò)程中能量代謝及凋亡相關(guān)蛋白的變化，通過(guò)Western blot法檢測(cè)糖酵解相關(guān)的HK-Ⅱ、MCT-1和PDK以及凋亡相關(guān)的Bax和Bcl-2蛋白水平的變化。由Fig 5可知，在經(jīng)過(guò)3-BP處理后的H1975細(xì)胞與陰性組相比，HK-Ⅱ、MCT-1蛋白明顯降低，促凋亡蛋白Bax明顯升高，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低，在蛋白水平也可表明3-BP對(duì)肺腺癌細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用。各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)Fig 7)。

Fig 7 Changes of glycolysis and apoptosis related proteins in H1975 cells by 3-BP*P<0.05 vs control group.

Fig 6 Changes of active oxygen and ATP levels in H1975 cells by 3-BPA: Active oxygen test result; B: ATP test result.**P<0.01 vs control group.

Fig 5 Effect of 3-BP on apoptotic rate of H1975 cellsA:Control group; B: 25 μmol·L-1 group; C: 50 μmol·L-1 group; D: 75 μmol·L-1 group.*P<0.05,**P<0.01 vs control group.

3 討論

糖酵解是腫瘤細(xì)胞獲取能量的主要方式，研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞通過(guò)糖酵解獲能多200倍。腫瘤細(xì)胞具有很高的葡萄糖攝取率和糖酵解代謝率，它們的大部分能量由糖酵解提供，同時(shí)保持乳酸生成速率的增加以獲得更加有利的生存環(huán)境。2-脫氧葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose，2-DG)和3-BP是目前研究中常用的兩種HK-Ⅱ抑制劑，在臨床前研究中均表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤作用，在最近的臨床試驗(yàn)中，2-DG治療前列腺癌和顱內(nèi)腫瘤的臨床試驗(yàn)已經(jīng)暫停，主要原因是藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常的非癌細(xì)胞也造成了損害，也可能對(duì)癌細(xì)胞有促進(jìn)生存作用[4,9-10]。3-BP作為小分子藥物，通過(guò)單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)抑制糖酵解來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。臨床前研究表明，在對(duì)肝癌大鼠采用動(dòng)脈灌注3-BP治療后，腫瘤平均壞死率高于對(duì)照組(即未給予治療組)，實(shí)驗(yàn)組瘤體細(xì)胞中VEGF和MMP9表達(dá)明顯下降，降低肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3-BP明顯抑制肺腺癌H1975細(xì)胞的增殖，明顯降低了H1975細(xì)胞的遷移能力。

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，具有不同的生化和遺傳途徑，有助于消除不必要的細(xì)胞，以保持機(jī)體健康平衡[12]。研究發(fā)現(xiàn)癌前病變中細(xì)胞凋亡受到了抑制，藥物治療后可以通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)清除潛在的有害DNA損傷細(xì)胞，從而阻止癌變。因此，凋亡途徑的失調(diào)可能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，而且使癌細(xì)胞對(duì)治療產(chǎn)生抵抗，如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也是癌癥治療的一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。Bax是一種促凋亡基因，當(dāng)其表達(dá)升高時(shí)可以改變線粒體膜的通透性，使其釋放促凋亡的細(xì)胞因子，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。Bcl-2通過(guò)與Bax結(jié)合拮抗其促凋亡作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，二者比值表明了細(xì)胞凋亡水平[14]。HK-Ⅱ的N端可以結(jié)合線粒體外膜電壓依賴性陰離子通道(VDAC)，阻止Bax與VDAC結(jié)合，維持線粒體穩(wěn)態(tài)，阻止促凋亡因子釋放，從而抑制細(xì)胞凋亡[15-16]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，3-BP誘導(dǎo)H1975細(xì)胞凋亡中伴隨著ATP水平下降和活性氧水平的升高，HK-Ⅱ活性受到抑制，MCT1表達(dá)下降，Bcl-2/Bax比值下降，3-BP可能通過(guò)抑制HK-Ⅱ活性從而抑制細(xì)胞糖酵解過(guò)程誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，本研究證明3-BP可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺腺癌H1975細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制糖酵解過(guò)程，下調(diào)Bcl-2并上調(diào)Bax的表達(dá)水平，引起線粒體膜通透性改變，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本研究表明3-BP對(duì)非小細(xì)胞肺腺癌具有潛在的治療價(jià)值，為3-BP治療非小細(xì)胞肺腺癌提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。