赫錦錦,方 東

(1. 河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 開(kāi)封 475000；2. 河南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南 開(kāi)封 475004)

原發(fā)性骨腫瘤或其他部位腫瘤(乳腺癌、前列腺癌、肺癌)的骨轉(zhuǎn)移都會(huì)導(dǎo)致骨癌痛的發(fā)生，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量[1]。臨床上用于骨癌痛的藥物主要是阿片類(lèi)藥物，然而這類(lèi)藥物具有耐受性和成癮性，因此臨床上亟需開(kāi)發(fā)鎮(zhèn)痛效果好、成癮性低的鎮(zhèn)痛藥物[2-3]。

蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿的干燥根、根莖及帶根全草可用于風(fēng)濕痹痛、腰痛、跌打損傷痛等痛證的治療，療效明顯[4-5]。大量研究表明，徐長(zhǎng)卿最主要的藥理成分是丹皮酚[6-7]，然而，徐長(zhǎng)卿丹皮酚(Paeonol of Cynanchum paniculatumhas, Paeonol)是否具有抗骨癌痛的作用還不清楚，因而本研究采用乳腺癌誘發(fā)的骨癌痛大鼠模型評(píng)價(jià)徐長(zhǎng)卿丹皮酚抗骨癌痛的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑徐長(zhǎng)卿丹皮酚(貨號(hào)：H111081)購(gòu)于阿拉丁公司(上海，中國(guó))，兔源TRPV1多克隆抗體(貨號(hào)：ab6166)，小鼠源transferrin receptor單克隆抗體(貨號(hào)：ab1086)購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，小鼠源β-actin單克隆抗體(貨號(hào)：TA-09)購(gòu)于中杉金橋(北京，中國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(貨號(hào)：sc-2054)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(貨號(hào)：sc-2973)購(gòu)于Santa Cruz公司(MN, USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雌性Sprague-Dawley大鼠購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。大鼠初始體質(zhì)量為(160～180) g，分籠飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房中，動(dòng)物房室溫控制在(23±2) ℃，相對(duì)濕度控制在70%±10%，大鼠自由飲水和飲食。

1.3 骨癌痛大鼠模型的建立將復(fù)蘇后的大鼠乳腺癌MRMT-1細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收集傳代2次后的細(xì)胞用于骨癌痛模型的建立。用PBS緩沖液將收集的MRMT-1細(xì)胞稀釋成1×1010個(gè)·L-1的細(xì)胞懸液，用微量進(jìn)樣器將4 μL上述細(xì)胞懸液(4×104個(gè))接種于大鼠左后肢脛骨骨髓腔內(nèi)，建立骨癌痛大鼠模型，對(duì)照組大鼠給予等量的PBS溶液。

1.4 機(jī)械痛閾值的測(cè)定按照Chaplan等[8]報(bào)道的“up and down”方法，測(cè)定大鼠左后肢的機(jī)械痛閾(paw withdrawal threshold，PWT)。首先將大鼠放置在用于測(cè)定機(jī)械痛的有機(jī)玻璃籠中，并保持室內(nèi)安靜以防大鼠出現(xiàn)躁動(dòng)。當(dāng)大鼠安靜后，用一系列標(biāo)準(zhǔn)化的von Frey hair刺激大鼠左后肢足墊中部，每次刺激持續(xù)時(shí)間約5 s，觀察大鼠是否出現(xiàn)縮足反應(yīng)，不同刺激之間相隔5 min以上，以消除上一次刺激對(duì)大鼠的影響，根據(jù)“up and down”方法計(jì)算50%縮足閾值。

1.5 熱輻射痛閾值的測(cè)定將大鼠置于有機(jī)玻璃套筒(18 cm × 6 cm × 6 cm) 內(nèi)，使其適應(yīng)30 min，待大鼠安靜后開(kāi)始測(cè)試。將熱輻射光源對(duì)準(zhǔn)大鼠左側(cè)足墊正下方，開(kāi)啟光源并計(jì)時(shí)，出現(xiàn)抬足現(xiàn)象為陽(yáng)性反應(yīng)，大鼠出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)后立即關(guān)閉熱輻射光源，記錄該次大鼠的抬足潛伏期(paw withdraw latency，PWL)。為了保證測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性，每只大鼠左后肢至少重復(fù)測(cè)量3次，每次測(cè)試間隔5 min以上，最后取3次PWL的平均值記為大鼠的熱輻射痛閾。

1.6 大鼠DRG中蛋白的提取及Western blot實(shí)驗(yàn)總蛋白的提?。捍笫髷囝^處死后，迅速取出左側(cè)L4，L5的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)置于1.5 mL EP管中，加入100 μL RIPA裂解液，以25%的強(qiáng)度超聲破碎DRG至無(wú)組織塊出現(xiàn)，將其放置在冰上繼續(xù)裂解30 min，然后12 000 r·min-1離心10 min，取上清，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，取40 μg總蛋白進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)。

膜蛋白的提取：取大鼠L4，L5 DRG置于玻璃研磨器中，加入800 μL膜成分提取液(0.3 mol·L-1Sucrose，10 mmol·L-1Tris，2 mmol·L-1EDTA，1 mmol·L-1PMSF，1 mmol·L-1DTT，10 mg·L-1Leupeptin)，按照Black等[9]的方法進(jìn)行超高速離心得到膜成分，之后用含有1% Triton X-100的RIPA裂解液冰上裂解1 h，12 000 r·min-1離心10 min后取上清，定量，取20 μg膜蛋白進(jìn)行Western blot 實(shí)驗(yàn)。

Western blot實(shí)驗(yàn)：每組樣品取等量的蛋白在10%的SDS-PAGE分離膠中以120 V的電壓進(jìn)行電泳分離2 h。電泳結(jié)束后，再通過(guò)200 mA的電流轉(zhuǎn)膜2 h，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。然后取出PVDF膜置于5%脫脂奶中室溫封閉1 h。封閉之后，使用5%脫脂奶分別稀釋TRPV1抗體(1：1 000)、β-actin抗體(1 ∶2 000)、transferrin抗體(1 ∶1 000)，4 ℃孵育上述抗體過(guò)夜。一抗孵育完成后，再在室溫下用相應(yīng)的二抗孵育1 h，采用ECL試劑盒顯色，用Quantity One軟件分析條帶光密度值。

1.7 電生理記錄大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性和TRPV1電流大鼠DRG神經(jīng)元的急性分離：斷頭處死大鼠，快速取出左側(cè)L4和L5 的DRG，置于預(yù)冷的DMEM培養(yǎng)基中，快速洗滌2次，加入1.5 mL膠原酶，37 ℃消化45 min；然后棄去膠原酶，用DMEM洗滌2次，加入1.5 mL胰酶，繼續(xù)消化10 min。當(dāng)胰酶消化結(jié)束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，然后加入新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基，用拋光后的巴斯德管吹打DRG，使神經(jīng)元分散至培養(yǎng)基中。最后將分散后的神經(jīng)元接種在24孔培養(yǎng)板中(24孔板中提前放置有多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的蓋玻片)，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。

全細(xì)胞膜片鉗記錄：選取直徑小于25 μm的DRG神經(jīng)元，在電流鉗模式下，將神經(jīng)元鉗制于0 pA，記錄各組神經(jīng)元的靜息膜電位(resting membrane potential，RMP)，此后采用階梯式給予一系列去極化電流，每次躍遷5 pA，持續(xù)100 ms，直至誘發(fā)出第一個(gè)動(dòng)作電位，即為動(dòng)作電位的去極化電流閾值(current threshold，CT)，并同時(shí)記錄動(dòng)作電位爆發(fā)的閾值(threshold of action potential，TP)。然后給予恒定去極化電流(300 pA, 500 ms)刺激DRG神經(jīng)元，記錄相同刺激下每個(gè)神經(jīng)元爆發(fā)動(dòng)作電位的個(gè)數(shù)。最后在電壓鉗模式下，將神經(jīng)元的電壓鉗制在-70 mV，執(zhí)行TRPV1受體激動(dòng)劑辣椒素(Capsaicin，CAP)灌流給藥步驟(細(xì)胞外液2 s，激動(dòng)劑3 s，細(xì)胞外液20 s)，記錄TRPV1電流。實(shí)驗(yàn)中采用EPC-10膜片鉗放大器和Patch master軟件來(lái)記錄和分析DRG神經(jīng)元的電活動(dòng)。

2 結(jié)果

2.1 徐長(zhǎng)卿丹皮酚對(duì)骨癌痛大鼠痛行為的影響大鼠造模后d 14測(cè)定大鼠機(jī)械痛閾和熱痛閾，d 15腹腔注射不同濃度的Paeonol，連續(xù)給藥3 d后，再次測(cè)定大鼠的機(jī)械痛閾和熱痛閾。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Paeonol能明顯提高骨癌痛大鼠的機(jī)械痛閾和熱輻射痛閾，并且具有劑量依賴(lài)性(Fig 1)。

2.2 徐長(zhǎng)卿丹皮酚對(duì)骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元興奮性的影響以往的研究表明，骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元興奮性會(huì)明顯增強(qiáng)，這也是骨癌痛的外周敏化機(jī)制[10]。因此，本研究首先急性分離給藥3 d后的骨癌痛大鼠的DRG神經(jīng)元，然后采用膜片鉗技術(shù)記錄DRG神經(jīng)元的電生理參數(shù)。結(jié)果表明，Paeonol(100 mg·kg-1)能明顯增加骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元靜息膜電位的絕對(duì)值，上調(diào)骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元誘發(fā)動(dòng)作電位的去極化電流閾值、動(dòng)作電位爆發(fā)的閾值(Fig 2)。同樣，Paeonol(100 mg·kg-1)也能降低300 pA去極化電流誘發(fā)的DRG神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢话l(fā)放的頻率(Fig 3)。這些結(jié)果表明，Paeonol能降低骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元的興奮性。

Fig 1 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on development of bone cancer pain of ratsNote that Paeonol of Cynanchum paniculatum could increase both the paw withdrawal threshold；(A) paw withdrawal latency (B) in a dose-dependent manner in bone cancer pain rats. n=8).*P<0.05, **P<0.01 vs normal saline group

2.3 徐長(zhǎng)卿丹皮酚對(duì)骨癌痛大鼠DRG上TRPV1蛋白表達(dá)的影響大量研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1在骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元上的表達(dá)明顯上調(diào)，并且介導(dǎo)了DRG神經(jīng)元的興奮性和骨癌痛的發(fā)生[1, 11]，因此本研究檢測(cè)了Paeonol(100 mg·kg-1)對(duì)骨癌痛大鼠DRG上TRPV1總蛋白和膜蛋白表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)給藥3 d后，Paeonol能夠明顯抑制骨癌痛大鼠DRG上TRPV1總蛋白和膜蛋白的表達(dá)(Fig 4)，這提示Paeonol很可能是通過(guò)下調(diào)TRPV1蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制神經(jīng)元興奮性和骨癌痛的發(fā)生。

Fig 2 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on DRG neurons hyperexcitability in bone cancer pain of ratsA： Representative of the first action potential evoked by depolarizing current pulse recorded from the DRG neurons；B： Paeonol of Cynanchum paniculatum reversed bone cancer-induced the decrease of the absolute values of resting membrane potential(RMP) in bone cancer pain rats； C： Bone cancer-induced the decreased values of current threshold (CT) was reversed by Paeonol of Cynanchum paniculatum； D： Paeonol of Cynanchum paniculatum attenuated the increased absolute values of threshold potential (TP) induced by bone cancer pain. n=25-26)*P<0.05, **P<0.01 vs Normal, #P<0.05, ##P<0.01 vs Normal saline.

Fig 3 Numbers of AP in DRG neurons decreased by Paeonol of Cynanchum paniculatum in bone cancer pain of ratsA： Representative of evoked discharges by a-500 ms, 300 pA depolarizing current pulse； B： Analysis of the evoked AP numbers. Note that the number of the evoked AP was significantly reduced in Paeonol-treated group. n=24-26) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs NS (Normal saline).

2.4 徐長(zhǎng)卿丹皮酚對(duì)骨癌痛大鼠DRG上TRPV1電流的影響Paeonol對(duì)TRPV1功能的影響尚不清楚，因此本研究采用膜片鉗技術(shù)記錄了TRPV1電流的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)3 d給予Paeonol(100 mg·kg-1)后，骨癌痛大鼠DRG神經(jīng)元上TRPV1的電流密度也明顯降低(Fig 5)。

Fig 5 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatumon TRPV1 currents in DRG neurons in bone cancer pain ratsA： Representative currents evoked by application of capsaicin (0.5 μmol·L-1 for 3 seconds) to DRG neurons in rats； B： Paeonol of Cynanchum paniculatum significantly decreased TRPV1 currents in DRG neurons in bone cancer pain rats. n=20) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs NS (Normal saline), 1-way ANOVA.

Fig 4 Effects of Paeonol of Cynanchum paniculatum on protein expression of TRPV1 in DRGs in bone cancer of rats Note that Paeonol of Cynanchum paniculatum reversed bone cancer-induced the up-regulation of TRPV1 total protein (A) and membrane protein (B) expression. β-actin and TfR (transferrin receptor) was used as an internal control. n=6) **P<0.01 vs Normal, ##P<0.01 vs Normal saline.

3 討論

徐長(zhǎng)卿味辛、性溫，無(wú)毒，歸肝、腎經(jīng)，臨床上常用于各種痛癥的治療，例如徐長(zhǎng)卿內(nèi)服或外用在治療牙痛、胃痛、腹痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、痛經(jīng)等方面有良好的止痛效果，但到目前為止還沒(méi)有文獻(xiàn)對(duì)徐長(zhǎng)卿發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的成分和作用機(jī)制進(jìn)行報(bào)道。本研究中，我們首次證明Paeonol可以通過(guò)下調(diào)TRPV1的表達(dá)進(jìn)而抑制神經(jīng)元的興奮性，從而治療骨癌痛。

然而，我們并沒(méi)有探討Paeonol下調(diào)TRPV1表達(dá)的機(jī)制，有文獻(xiàn)報(bào)道，丹皮酚具有抗炎、抗氧化的作用[12]，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)，丹皮酚可以抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[14-15]，而TNF-α、IL-6可以通過(guò)MEK/ERK、PI3K/AKT等多條信號(hào)通路上調(diào)TRPV1蛋白的表達(dá)和功能的敏化，并且在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這些炎癥因子的表達(dá)也明顯上調(diào)[11, 15]，因此我們推測(cè)Paeonol很可能是通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而抑制TRPV1蛋白表達(dá)和功能的敏化。

除了TRPV1受體，在外周DRG神經(jīng)元上還有很多受體或離子通道參與了骨癌痛的外周敏化，例如Nav1.8通道及KCNQ通道等[16]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)使用Paeonol后，DRG神經(jīng)元膜電位絕對(duì)值增大，而TRPV1對(duì)細(xì)胞膜電位影響并不明顯，因此我們推測(cè)Paeonol也可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)Nav1.8通道及KCNQ通道的表達(dá)或功能進(jìn)而發(fā)揮抗骨癌痛的作用，當(dāng)然這些假說(shuō)還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。