白穎鋒，李雪梅，韓 笑，劉 佳，陸兔林，毛春芹，杭愛武

(南京中醫(yī)藥大學(xué)1.中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)教研室、2.藥學(xué)院中藥炮制學(xué)教研室，江蘇 南京 210023)

肝損傷是臨床肝系疾病常有的一種病理狀態(tài)。長(zhǎng)期肝損傷會(huì)導(dǎo)致疾病向肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的方向轉(zhuǎn)化?？垢螕p傷成為臨床治療肝病的重要環(huán)節(jié)，近年來肝損傷也成為了肝病研究的一大熱點(diǎn)問題。

山茱萸、牡丹皮配伍出自于張仲景《金匱要略》的腎氣丸，宋代錢乙的《小兒藥證直訣》將腎氣丸加減化裁為六味地黃丸。此后六味地黃丸的臨床應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)展，至清代高秉鈞在《瘍科心得集》中說明六味地黃丸可以治“肝腎不足”等證?，F(xiàn)代臨床用藥規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，治療肝硬化的二對(duì)藥常見配伍中包含山茱萸和牡丹皮[1]。藥理研究也將六味地黃丸拆成3個(gè)“一補(bǔ)一瀉”配伍[2]，即山茱萸與丹皮，熟地與澤瀉，山藥與茯苓?，F(xiàn)代臨床運(yùn)用和實(shí)驗(yàn)研究拓展了中藥的應(yīng)用范圍。

中藥中含有復(fù)雜的成分，是天然的化合物寶庫，中藥成分、組分配伍成為名優(yōu)中藥二次開發(fā)的重要途徑。通過中藥數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)方法，可以預(yù)測(cè)中藥治療疾病的有效成分與潛在靶點(diǎn)，并篩選有效的中藥配伍。為分析山茱萸、牡丹皮兩藥及配伍后抗肝損傷的潛在活性成分和靶點(diǎn)，試從如下方面進(jìn)行探討。

1 方法

1.1 山茱萸、牡丹皮化學(xué)成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

1.1.1潛在活性成分的獲得與篩選 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(traditional chinese medicine systems pharmacology database，TCMSP)中分別收集山茱萸和牡丹皮的化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 0.30、類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選潛在活性成分。

1.1.2潛在活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) PubChem中收集潛在活性成分的SMILE結(jié)構(gòu)式，并下載SDF格式的結(jié)構(gòu)文件。利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫和相似系綜(similarity ensemble approach，SEA)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，均選擇人類數(shù)據(jù)庫(homo sapiens)。標(biāo)準(zhǔn)見Tab 1。

Tab 1 Target prediction criteria for potential active ingredients

1.2 山茱萸、牡丹皮抗肝損傷靶點(diǎn)的獲得在治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(therapeutic target database，TTD)、遺傳關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(genetic association database，GAD)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫的搜索功能中檢索 “Liver disease” “Liver injury” “Liver” “Hepatic”等關(guān)鍵詞，篩選出疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將潛在活性成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)比對(duì)并取交集，獲得山茱萸、牡丹皮抗肝損傷的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過Uniprot獲得各靶點(diǎn)Uniprot ID備用。

1.3 GO富集分析與KEGG通路富集分析利用注釋、可視化和綜合發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(the database for annotation, visualization and integrated discovery，DAVID)的Functional Annotation功能，進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路分析。物種選擇人類(homo sapiens)。

1.4 “中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1軟件中，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 應(yīng)用受試者工作特性曲線評(píng)價(jià)核心靶點(diǎn)將中藥抗肝損傷的靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算自由度，并挑選出網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)。利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中的相關(guān)數(shù)據(jù)集，構(gòu)建疾病-對(duì)照的模型驗(yàn)證集，用受試者工作特性(receiver operator characteristic，ROC)曲線評(píng)價(jià)核心靶點(diǎn)與非酒精性脂肪肝炎過程肝損傷的關(guān)聯(lián)程度。

2 結(jié)果

2.1 山茱萸、牡丹皮的潛在活性成分與潛在靶點(diǎn)經(jīng)篩選得到山茱萸活性成分20個(gè)，牡丹皮活性成分11個(gè)(Tab 2、3)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)分析得到，山茱萸潛在靶點(diǎn)共776個(gè)，牡丹皮潛在靶點(diǎn)共625個(gè)。

2.2 山茱萸、牡丹皮抗肝損傷靶點(diǎn)的篩選疾病數(shù)據(jù)庫篩選出疾病靶點(diǎn)共有677個(gè)(已排除重復(fù)信息)。中藥預(yù)測(cè)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)與疾病靶點(diǎn)取交集后，得到山茱萸、牡丹皮活性成分作用的靶點(diǎn)分別為52個(gè)和69個(gè)。篩去重復(fù)信息，得到山茱萸、牡丹皮抗肝損傷靶點(diǎn)共78個(gè)，其中共同靶點(diǎn)43個(gè)(Tab 4)。

Tab 4 Information of targets

Tab 3 Information of active ingredients in Cortex moutan

Tab 2 Information of active ingredients in Fructus corni

2.3 GO富集分析與KEGG通路富集分析GO富集分析包括生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(Cellular component，CC)和分子功能(Molecular function，MF)3個(gè)部分，3者均設(shè)置P<0.05。GO-BP分析共有194個(gè)結(jié)果，包含類固醇代謝、外源性物質(zhì)代謝、類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、血管生成等途徑；GO-CC分析有24個(gè)結(jié)果，影響到細(xì)胞器膜、細(xì)胞外空間、膜孔、質(zhì)膜、細(xì)胞表面等細(xì)胞組分；GO-MF分析有62個(gè)結(jié)果，對(duì)于RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體活性、酶結(jié)合、氧結(jié)合、血紅素結(jié)合等分子功能。

將山茱萸、牡丹皮抗肝損傷的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集進(jìn)行KEGG通路分析，設(shè)定P<0.05，得到68條通路結(jié)果，剔除與肝損傷無關(guān)的特定疾病通路后結(jié)果為32條。富集的通路主要為低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia-inducible factors1，HIF-1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、膽汁分泌(bile secretion)、胰島素抵抗(insulin resistance)、細(xì)胞色素P450代謝外源性物質(zhì)(cytochrome P450)、小分子G蛋白R(shí)as、脂肪細(xì)胞因子(adipocytokine)、小分子G蛋白R(shí)ap1、丙型肝炎等信號(hào)途徑。按P值升序排列，使用R語言將GO分析各部分和KEGG分析排名前10的結(jié)果分別繪制成如下圖(Fig 1、2)。

2.4 “中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的繪制將32條通路相關(guān)的靶點(diǎn)、化合物數(shù)據(jù)整理出來，并采用Cytoscape3.2.1軟件繪制“中藥-化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 3)。其中共有108個(gè)節(jié)點(diǎn)，447條邊。節(jié)點(diǎn)有中藥2味，化合物27個(gè)，靶點(diǎn)46個(gè)，通路32條，疾病1個(gè)。根據(jù)自由度從高到低排列，槲皮素(quercetin，19)、山奈酚(kaempferol，14)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，12)、谷甾醇(sitosterol，12)、豆甾醇(stigmasterol，12)等可能是發(fā)揮藥效的主要成分；絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT serine/threonine kinase 1，AKT1，26)、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亞基γ(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma，PIK3CG，25)、蛋白酪氨酸磷酸酶非受體1型(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 1，PTPN1，19)、絲裂原活化蛋白激酶8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8，17)、過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA，16)、ATP結(jié)合盒亞家族B成員1(ATP binding cassette subfamily B member 1，ABCB1，16)、腫瘤壞死因子(TNF，16)、Jun原癌基因(Jun proto-oncogene，JUN，13)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR，12)、細(xì)胞色素P450家族2亞家族C成員19(cytochrome P450 family 2 subfamily C member 19，CYP2C19，11)等可能是山茱萸、牡丹皮抗肝損傷的重要靶點(diǎn)。

Fig 1 Results of GO enrichment analysis(TOP10)

Fig 2 Result of KEGG enrichment analysis(TOP10)

2.5 ROC曲線評(píng)價(jià)結(jié)果將靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫后，按綜合得分≥0.90為標(biāo)準(zhǔn)篩選數(shù)據(jù)，繪制網(wǎng)絡(luò)見Fig 4，包含59個(gè)節(jié)點(diǎn)，121條邊。GEO數(shù)據(jù)庫中篩選得到GSE63067數(shù)據(jù)集，其中有非酒精性脂肪肝炎臨床樣本9例，健康樣本7例，對(duì)數(shù)據(jù)集進(jìn)行探針去重、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、分組驗(yàn)證(Fig 5)，利用“Limma”包進(jìn)行差異分析后，將蛋白網(wǎng)絡(luò)中自由度前9的靶點(diǎn)輸入驗(yàn)證集進(jìn)行驗(yàn)證，并繪制ROC曲線(Fig 6)，圖中括號(hào)表示ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)在0.95下的置信區(qū)間。AUC在0～0.50、>0.50～0.70、>0.70～0.90和>0.90～1分別表示關(guān)聯(lián)程度的四個(gè)等級(jí)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、MAPK8和CYP2C19的AUC分?jǐn)?shù)均處于>0.70～0.90之間。與健康對(duì)照組比較，疾病組的VEGFA、ESR1、MAPK8的表達(dá)具有明顯差異(P<0.05)，CYP2C19的表達(dá)不明顯。

Fig 6 Results of ROC

Fig 5 Heatmap(Top 200)

Fig 4 Protein-protein interaction network

Fig 3 “Chinese medicine-compound-target-pathway-disease”network of Fructus corni and Cortex moutan for treating liver injury

3 討論

3.1 山茱萸、牡丹皮抗肝損傷潛在活性成分研究結(jié)果顯示，山茱萸、牡丹皮中篩選出的成分以黃酮和甾醇類為多，如槲皮素、山奈酚等黃酮類成分，β-谷甾醇、豆甾醇等甾醇類；另外有沒食子酸衍生物等鞣質(zhì)，芍藥苷、丹皮苷等苷類成分，四氫苦參堿等生物堿，以及一些有機(jī)酸。

中藥包含的成分種類豐富，在中藥抗肝損傷網(wǎng)絡(luò)中可能發(fā)揮協(xié)同作用。核心成分槲皮素對(duì)脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，可明顯減少TNF-α等炎癥細(xì)胞因子，通過抑制核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)和MAPK信號(hào)通路的活化起到抗凋亡和抗炎作用[3]。山奈酚可下調(diào)細(xì)胞色素CYP2E1表達(dá)，恢復(fù)抗氧化酶活性達(dá)到保肝作用，也可以明顯減弱非甾體抗炎藥乙酰氨基酚誘導(dǎo)的血清TNF-α和白細(xì)胞介素-6(interleukin 6，IL-6)的產(chǎn)生，下調(diào)c-Jun氨基末端激酶和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶的磷酸化，減少肝細(xì)胞凋亡[4]。β-谷甾醇和它的衍生物可明顯降低炎癥因子TNF-α等的水平，抑制Toll受體4(Toll like receptor 4，TLR4)和NF-κB介導(dǎo)的氧化和炎癥反應(yīng)改善脂多糖/D-氨基半乳糖誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[5]。課題組前期研究表明，山茱萸環(huán)烯醚萜總苷可以增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，降低凋亡蛋白表達(dá)，發(fā)揮保肝作用[6]。

3.2 山茱萸、牡丹皮配伍抗肝損傷的潛在靶點(diǎn)KEGG富集分析結(jié)果中包含的成分有27個(gè)，成分通過46個(gè)靶點(diǎn)映射到疾病相關(guān)的32條通路上，共含有447條邊，體現(xiàn)了成分、靶點(diǎn)與通路3者關(guān)聯(lián)密集，構(gòu)成了完整又系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)，說明中藥治療疾病的整體性與系統(tǒng)性，也在一定程度上體現(xiàn)了中醫(yī)理論中“異病同治，同病異治”的觀點(diǎn)。

在網(wǎng)絡(luò)圖中由自由度排列篩選出來的10個(gè)基因是山茱萸、牡丹皮配伍抗肝損傷的潛在靶點(diǎn)。AKT1在PI3K/AKT1信號(hào)途徑中占核心地位，是細(xì)胞存活的信號(hào)介質(zhì)。在通路中，一類PI3K可以激活下游信號(hào)通路，參與細(xì)胞活化、增殖和分化，PI3K抑制劑可在肝纖維化過程中抑制肝星狀細(xì)胞的活化，緩解肝損傷[7]。PTPN1是一種胞內(nèi)酶，又稱PTP1B，膽汁淤積期間，肝細(xì)胞中的膽汁酸激活炎癥通路，慢性輕度炎癥會(huì)誘導(dǎo)PTPN1的表達(dá)，而PTPN1的缺失可以保護(hù)膽汁酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[8]。當(dāng)肝臟暴露于毒性物質(zhì)或部分切除時(shí)會(huì)迅速開始再生的過程，PPARA可能是通過影響脂質(zhì)代謝和直接調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因影響肝再生[9]，EGFR信號(hào)軸已被證明在急性和慢性肝損傷后的肝再生過程中起關(guān)鍵作用[10]。藥物在治療疾病過程中其代謝產(chǎn)物也有可能對(duì)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能有損傷。臨床報(bào)道阿托伐他汀由CYP3A4、CYP2C19等代謝，隨后其代謝產(chǎn)物被ABCB1介導(dǎo)從肝臟到膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)消除，ABCB1的基因多態(tài)性與阿托伐他汀導(dǎo)致的肝損傷有關(guān)[11]，可從基因出發(fā)研究藥物性肝損傷的緩解機(jī)制。

3.3 非酒精性脂肪肝過程中的肝臟損傷非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一系列病理過程的總括，包括肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)等。肝損傷是NAFLD過程中持續(xù)性的病理反應(yīng)。肝臟代謝脂肪酸的能力降低導(dǎo)致有毒脂質(zhì)的堆積，從而誘導(dǎo)肝細(xì)胞應(yīng)激、損傷和死亡。

GEO數(shù)據(jù)庫基于基因芯片技術(shù)，構(gòu)建疾病驗(yàn)證集之后，應(yīng)用ROC曲線評(píng)價(jià)核心靶點(diǎn)與非酒精性脂肪肝炎過程中肝損傷的關(guān)聯(lián)程度，在非酒精性脂肪肝炎病理過程中肝臟損傷程度較高。VEGFA是誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵因子。在非酒精性脂肪肝從普通脂肪變性轉(zhuǎn)為NASH的過程中，脂肪過度堆積，誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥，招募單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血小板聚集，通過不同途徑來啟動(dòng)血管生成。與健康對(duì)照組相比，普通脂肪變性和NASH患者血清TNF-α和IL-6水平升高，可溶性VEGF受體1(sVEGFR1)水平明顯升高，說明血管生成細(xì)胞因子參與了非酒精性脂肪肝的病理轉(zhuǎn)變過程[12]。ESR1被報(bào)道與脂質(zhì)代謝有關(guān)，其過度表達(dá)可能與肝臟脂肪堆積有關(guān)，這是非酒精性脂肪肝發(fā)展的第一步，并可能演變成為NASH、肝硬化及肝癌，在肥胖相關(guān)的肝臟脂肪變性的發(fā)病機(jī)制中，ESR1啟動(dòng)子甲基化圖譜似乎發(fā)揮了表觀遺傳標(biāo)記的作用[13]。

生物信息學(xué)通過差異基因分析，篩選臨床疾病樣本與健康樣本中差異表達(dá)明顯的靶點(diǎn)，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的中藥治療疾病靶點(diǎn)，可以將研究重點(diǎn)聚焦到少數(shù)基因；其局限性是研究樣本來自臨床，使驗(yàn)證難度增加。

通過多種數(shù)據(jù)庫和平臺(tái)構(gòu)建的中藥山茱萸、牡丹皮抗肝損傷作用網(wǎng)絡(luò)包含多成分、多靶點(diǎn)、多途徑，其中抗肝損傷核心成分以黃酮類和甾醇類為主，如槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等，部分潛在活性成分可能成為保肝藥物的候選成分，也為中藥成分、組分配伍提供參考。篩選得到的網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)如AKT1、PIK3CG、PTPN1、MAPK8、PPARA等，可作為研究山茱萸、牡丹皮抗肝損傷可能機(jī)制的著手點(diǎn)，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。在ROC曲線評(píng)價(jià)中，VEGFA、ESR1和MAPK8與非酒精性脂肪肝炎過程中肝損傷的關(guān)聯(lián)程度較高。綜合生物信息學(xué)可以分析疾病的潛在靶點(diǎn)，也為中藥治療疾病潛在機(jī)制的研究提供思路。