李 潔，鄭涵予，王沂雯，鐘 焱，劉興艷，陳安均

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安62500）

【研究意義】余甘子（Phyllanthus emblicaL.）是一種大戟科中小型落葉喬木的果實(shí)，主要生長在中國、印度等亞熱帶和熱帶地區(qū)[1]。余甘子含豐富的營養(yǎng)，可作為礦物質(zhì)、氨基酸和抗壞血酸的重要膳食來源[2]。余甘子還含有黃酮、多酚、生物堿、有機(jī)酸和甾醇等具有抗氧化能力和清除自由基能力的生物活性物質(zhì)，有降血壓、降血脂、抗腫瘤、防止動(dòng)脈粥樣硬化、消炎鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等功能[3]。中國余甘子產(chǎn)量大，大多長在山區(qū)，開發(fā)利用率很低，造成資源浪費(fèi)和山區(qū)經(jīng)濟(jì)的落后，若將余甘子開發(fā)成果酒將有利于資源的合理利用和促進(jìn)山區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果酒的香氣主要是通過果實(shí)發(fā)育和果酒發(fā)酵過程產(chǎn)生的一系列如醇類、酯類、醛類等香氣成分[5]，作為果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，其香氣直接影響果酒的風(fēng)味品質(zhì)。楊婷[6]等研究表明4 株不同的釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)生的甜瓜酒的香氣含量及香氣特征之間存在差異性；李凱[7]等研究發(fā)現(xiàn)不同商業(yè)釀酒酵母釀制的玫瑰香葡萄酒的香氣輪廓存在差異。目前暫無對余甘子酒的揮發(fā)性香氣成分的研究。【本研究切入點(diǎn)】傳統(tǒng)的感官評價(jià)是評定果酒感官質(zhì)量最有效可行的方法，但容易受較多主觀因素影響，采用GC-MS可以有效地分離出酒中的香氣成分并作出鑒定[8]。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)以涼山野生余甘子為原料釀制余甘子果酒，探究不同的酵母菌株對余甘子酒揮發(fā)性香氣成分及感官質(zhì)量的影響，并采用模糊綜合評判將感官質(zhì)量與揮發(fā)性香氣成分結(jié)合以期篩選適合余甘子酒的酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子：購自涼山州鹽源縣金河鄉(xiāng)；5 株活性干酵母菌株：EC1118 和D254 為法國拉曼公司產(chǎn)品，Top15、Aroma white和Perlage為意大利英納帝斯公司產(chǎn)品。

發(fā)酵助劑：酵母多糖，愛賽科有限公司。添加發(fā)酵助劑的主要作用是為提高酵母發(fā)酵速率，使酵母發(fā)酵徹底。

壬酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品，美國sigma 公司；果膠酶（5 萬U/g），寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；DPPH，2，4，6-三吡啶基三嗪、亞硝酸鈉、硝酸鋁、抗壞血酸、沒食子酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C GC-MS，美國安捷倫公司；3001-2207 全波段酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 余甘子酒的加工工藝 余甘子→挑選清洗→去核→酶解→糖水混合→成分調(diào)整→接種酵母→添加發(fā)酵助劑→倒罐→后發(fā)酵→陳釀，操作要點(diǎn)如下。

（1）酶解：添加0.01 g/kg的果膠酶，40 ℃酶解3 h，然后95 ℃滅酶5 min；

（2）糖水混合：余甘子原料含水量較少，TSS為14.5%，將余甘子果肉與糖水按1:2混合打漿使余甘子果漿的TSS為23%；

（3）成分調(diào)整：余甘子果漿的pH值較低為2.7，不利于酵母菌株的發(fā)酵，因此將果漿調(diào)整pH值為3.3，并加入80 mg/L SO2密封3 h；

（4）接種酵母：按總體積稱取0.25 g/kg的活性干酵母，然后加入至20 mL 10%糖水中，38 ℃活化0.5 h后添加至發(fā)酵罐中[9]；

（5）添加發(fā)酵助劑：取0.4 g/L的酵母多糖，用少量水溶解，在總糖消耗掉1/3時(shí)添加；

（6）后發(fā)酵：待發(fā)酵14 d 后將余甘子酒用300 目濾袋去除果肉后放置于1 000 mL 廣口瓶中于干燥的環(huán)境中進(jìn)行后發(fā)酵。后發(fā)酵期間溫度控制在20～25 ℃，密封好廣口瓶盡量避免與空氣接觸以防止雜菌的污染。

（7）發(fā)酵終點(diǎn)：根據(jù)CO2失重法，待酒液質(zhì)量基本保持不變時(shí)結(jié)束發(fā)酵。

（8）陳釀：在發(fā)酵好的余甘子酒中加入50 mg/L 的SO2后放置在室溫下進(jìn)行密封陳釀。陳釀時(shí)間為2～3個(gè)月。

1.3.2 余甘子酒指標(biāo)的測定 （1）酒精度、總糖、揮發(fā)酸、總酸、甲醇：參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[10]；

（2）揮發(fā)性香氣成分：參考劉娟[11]的方法，具體如下：

固相微萃取條件：取8 mL酒樣、30%NaCl和5.0μL 200 mg/L環(huán)己酮于15 mL頂空固相微萃取樣品瓶中，加蓋密封后在60 ℃的氣浴恒溫震蕩器下震蕩10 min。將萃取頭（30/50μm DVB/CAR/PDMS）插入頂空固相微萃取樣品瓶中推出纖維于60 ℃水浴鍋下萃取吸附30 min后取出進(jìn)行氣質(zhì)測定。

GC 條件：HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流進(jìn)樣，柱溫采用程序升溫，40 ℃保持8 min，以5 ℃/min 升至185 ℃保持1 min，再以10 ℃/min 的速度升至230 ℃保持23 min，總用時(shí)65 min，進(jìn)樣口溫度260 ℃，檢測器溫度250 ℃，載氣He，流速為1.0 mL/min。

MS 條件：電離方式EI，電離電壓70 ev，燈絲電流0.25 mA，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍30～350 m/z。

（3）感官評定：待發(fā)酵結(jié)束后余甘子果酒陳釀3 個(gè)月后進(jìn)行感官評價(jià)。評分標(biāo)準(zhǔn)參考魏永春等的標(biāo)準(zhǔn)[12]略作修改，具體見表1。

表1 余甘子酒感官評定標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Sensory evaluation criteria for Phyllanthus wines

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）表示。使用SPSS 20.0軟件作統(tǒng)計(jì)分析以及主成分分析（PCA）。差異的顯著性水平為P<0.05，不同字母表示具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌株對余甘子酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)的影響

研究了5 株酵母菌株所發(fā)酵余甘子酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)，由表2 可知，5 種余甘子酒的酒精體積濃度在10.50%～11.11%，Perlage 釀制的余甘子酒酒精體積濃度顯著低于其他酒（P<0.05），同時(shí)酒精體積濃度含量最低，這表明Perlage 酵母的糖利用率要低于其余4 種酵母；5 種酒樣的甲醇含量在0.16～0.28 g/L，Perlage 與EC1118 釀制的余甘子酒甲醇含量顯著低于其他酒（P<0.05）。EC1118 和Top15 釀制的余甘子酒揮發(fā)酸含量較低，分別為0.41 和0.42 g/L；D254 釀制的余甘子酒揮發(fā)酸含量最高，為0.67 g/L。5 種余甘子酒總酸含量在8.15～9.34 g/L，pH 值在3.42～3.52，果酒中適量的酸能夠柔和其苦澀味，且高酸產(chǎn)生的低pH 環(huán)境能夠防止雜菌污染[13]。

表2 酵母菌株對余甘子酒基礎(chǔ)理化指標(biāo)的影響Tab.2 Effect of yeast strains on basic physical and chemical indicators ofPhyllanthuswines

2.2 不同酵母所發(fā)酵余甘子酒的揮發(fā)性香氣成分

由表3 可知，5 種酵母菌株釀制的余甘子酒在香氣成分的種類與含量上均存在一定差異，與Li 等[14]的研究結(jié)果一致，即酵母菌株對香氣成分有顯著的影響。5種酒樣共鑒定了47種香氣成分，醇類8種、酯類18種、醛酮類7種、酸類2種以及其它類12種，其中有21種是5 種酒樣共有的，說明5 種酵母釀制的余甘子酒都擁有主體特征香氣組分，同時(shí)也有其獨(dú)有的香氣成分，在種類和含量上存在一定的差異性，其中Perlage 釀制的酒樣種類最豐富，EC1118 釀制的酒樣香氣總含量最高。5 種酒樣醇類和酯類物質(zhì)含量均較高，為余甘子酒的主要香氣成分。

2.2.1 醇類 醇類物質(zhì)是果酒中重要風(fēng)味物質(zhì)，如表3 所示，5 種余甘子酒中共檢出8 種醇類物質(zhì)，含量在332.72～523.41μg/L，EC1118 釀制的酒中醇類物質(zhì)含量最高，說明EC1118 的產(chǎn)醇能力總體優(yōu)于其余4 種酵母；異戊醇、2,3-丁二醇、苯乙醇在5 種酒樣中均檢出且含量較高，是余甘子酒主體香氣成分之一。有研究表明，少量的高級(jí)醇能賦予果酒優(yōu)雅的香氣，使果酒香氣更加完美[15]，如異戊醇有蘋果白蘭地香氣和辛辣味，被認(rèn)為是高級(jí)醇中最重要的揮發(fā)性物質(zhì)[6]，苯乙醇有類似于玫瑰、紫羅蘭、茉莉花等香味，少量的濃度就能產(chǎn)生很高的玫瑰香味，是果酒中主要的呈香物質(zhì)之一[16]。5 種酒樣中，D254 釀制的酒樣中異戊醇含量最高，EC1118 釀制的酒樣中苯乙醇含量最高。2,3-丁二醇是酒類中極少呈香的多元醇之一，主要呈現(xiàn)出淡雅細(xì)膩的玫瑰香氣，EC1118 釀制的酒樣中2,3-丁二醇含量顯著高于其它4 種酒樣（P<0.05）。

表3 不同酵母所發(fā)酵余甘子酒的揮發(fā)性香氣成分Tab.3 Volatile aroma components ofPhyllanthuswines fermented by different yeastsμg·L-1

2.2.3 醛酮類 醛酮類化合物是一類產(chǎn)生令人愉快的水果香和花香的化合物[17]。在余甘子酒樣中一共檢測出7 種醛酮類物質(zhì)，含量在11.93～34.13μg/L。苯甲醛和2,4-二甲基苯甲醛在5 種酒樣中均有檢出。苯甲醛具有甜杏仁、櫻桃和堅(jiān)果的風(fēng)味，EC1118 釀制的余甘子酒中苯甲醛含量最高；2,4-二甲基苯甲醛具有櫻桃、杏仁、香料和香草的風(fēng)味，其含量在5 種酒樣中差異不顯著（P>0.05）。壬醛和癸醛是Perlage釀制的酒樣特有，壬醛具有強(qiáng)烈的脂肪臭和果香香氣，癸醛具有類似檸檬油的脂蠟狀香氣。

2.2.4 脂肪酸類 短鏈到中鏈脂肪酸如正己酸、正辛酸、癸酸的產(chǎn)量一般較低，這對果酒的芳香氣味是積極的[20]。在5種酒樣中僅檢出2種脂肪酸，癸酸和辛酸，含量在10.43～38.37μg/L，癸酸在5種酒樣中均有檢出，辛酸僅在Aroma white、D254和Perlage釀制的酒樣中檢出。辛酸屬于低級(jí)脂肪酸，具有明顯奶酪和粗澀的味感，但卻能平衡果酒的香氣，抑制芳香酯的水解，對整體酒質(zhì)結(jié)構(gòu)具有重要作用[21]。

2.3 揮發(fā)性香氣成分含量的主成分分析

為了能較準(zhǔn)確的判別出不同酵母對余甘子酒中揮發(fā)性香氣成分的影響，對5種酒樣中共有的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了主成分分析。其主成分的特征值及貢獻(xiàn)率見表4。前3 個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到了87.05%，能基本反應(yīng)酒中的揮發(fā)性香氣成分的差異，其特征值均大于1，因此選用前3個(gè)主成分進(jìn)行分析。

由圖1 可知，不同酵母發(fā)酵所得余甘子酒中的揮發(fā)性香氣成分之間存在一定差異，可以通過5 種酒樣的前3 個(gè)主成分得分來區(qū)分不同酵母所發(fā)酵的余甘子酒，由于酵母Top15 和EC1118 發(fā)酵的余甘子酒的前3 主成分得分相近，因此將其歸為1 類，而其余酵母發(fā)酵得到的余甘子酒前3主成分得分相差較大，因此各為1類，故5 種酵母發(fā)酵的余甘子酒通過香氣成分可以分為4 類。圖1 同時(shí)也表示47 種揮發(fā)性香氣成分載荷圖，因子的載荷系數(shù)越大表明該香氣成分對主成分越重要。由此可以看出，橙花叔醇（0.963）、苯甲酸乙酯（0.967）、辛酸乙酯（0.908）、癸酸乙酯（0.980）、月桂酸乙酯（0.899）、鄰苯二甲酸二丁酯（0.921）、9-十六碳烯酸乙酯（0.975）、壬醛（0.975）、葵醛（0.975）、苯乙烯（0.961）、順-β-金合歡烯（0.975）、1-乙氧基戊烷（0.975）與第一主成分呈正相關(guān)；2,3-丁二醇（0.969）、癸酸（0.921）與第二主成分呈正相關(guān)，而丁二酸二乙酯（-0.839）與第二主成分呈負(fù)相關(guān)；十八烷（0.858）、正二十五烷（0.877）、二十烷（0.877）、十六烷（0.858）、十七烷（0.877）與第三主成分呈正相關(guān)，苯乙醇（-0.917）與第三主成分呈負(fù)相關(guān)。Perlage 釀制的余甘子酒第一成分得分最高，這是因其擁有最高的苯甲酸乙酯、辛酸乙酯，且9-十六碳烯酸乙酯、壬醛、葵醛、順-β-金合歡烯、1-乙氧基戊烷是Perlage釀制的余甘子酒所特有的揮發(fā)性香氣成分；EC1118 釀制的余甘子酒第二主成分得分最高，這與擁有最高的2,3-丁二醇、葵酸有關(guān)；D254釀制的余甘子酒第三主成分得分最高。

圖1 揮發(fā)性香氣成分的主成分分析Fig.1 Principal component analysis of volatile aroma components

表4 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率Tab.4 characteristic values and contribution rates of principal components

2.4 酵母菌株對余甘子酒的感官評價(jià)

對5種不同酵母發(fā)酵所得余甘子酒進(jìn)行感官評定，由表5可知，EC1118所釀制余甘子酒感官得分最高，為80.6分。Top15釀制的余甘子酒感官得分顯著低于其它酒樣（P<0.05）。

表5 不同酵母對余甘子酒感官得分的影響Tab.5 Effect of different yeasts on sensory scores ofPhyllanthuswines

2.5 模糊綜合評判

由于感官評價(jià)有一定的主觀性，不能準(zhǔn)確地篩選出最佳的酵母菌株。將不同酵母釀制的余甘子酒的感官評分結(jié)合余甘子揮發(fā)性香氣成分的質(zhì)量濃度進(jìn)行分析，利用模糊綜合評判法優(yōu)選出最適合余甘子酒的酵母菌株。

（1）建立判別對象集。U={U1,U2,U3,U4,U5}，其中：U1：Aroma white 釀制的酒樣；U2：D254 釀制的酒樣；U3：EC1118釀制的酒樣；U4：Perlage釀制的酒樣；U5：Top15釀制的酒樣。

使用COMSOL軟件進(jìn)行多物理場耦合計(jì)算。采用四面體網(wǎng)格和邊界層網(wǎng)格進(jìn)行網(wǎng)格劃分。網(wǎng)格獨(dú)立性檢驗(yàn)如下：對三分支微通道熱沉的參數(shù)最大熱應(yīng)力σ進(jìn)行檢驗(yàn)，粗化網(wǎng)格、標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格、細(xì)化網(wǎng)格的網(wǎng)格數(shù)量分別為105564、265365、422340，粗化網(wǎng)格與標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格計(jì)算下的相對誤差為0.42%，細(xì)化網(wǎng)格與標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格計(jì)算下的相對誤差為0.27%。綜合考慮計(jì)算精度和計(jì)算時(shí)間，采用標(biāo)準(zhǔn)網(wǎng)格劃分，如圖3所示。

（2）建立評判因素集。由評判對象香氣成分的分類，可以得出醇類和酯類化合物為主要因素，結(jié)合感官評價(jià)表建立判別因子集。

X={X1,X2,X3}，其中：X1：感官得分；X2：主要醇類化合物含量；X3：主要酯類化合物含量。

（3）建立評判因素集。根據(jù)表4構(gòu)造感官評分因素的隸屬度函數(shù)

由于余甘子酒的香氣成分含量與酒品質(zhì)呈正相關(guān)，故可構(gòu)造線形上升的隸屬函數(shù)。結(jié)合表3構(gòu)造醇類、酯類隸屬度函數(shù)表達(dá)式分別：

（4）建立權(quán)重集。經(jīng)分析表明，酯類化合物較醇類化合物對果酒的呈香特征貢獻(xiàn)大，再結(jié)合感官評價(jià)，根據(jù)德爾菲法[22]，確定判斷中的權(quán)利分配：A={a1,a2,……an}={a1,a2,a3}={0.35,0.30,0.35}。其中（i=1,2,……n）。

（5）模糊綜合評判計(jì)算。對Ui的每一因子利用U（Xi）進(jìn)行模糊化，可得到X×U上的模糊關(guān)系距陣

用模糊線性變換，得到的評判結(jié)果為：

其中，模糊算子為M（×，⊕），結(jié)果歸一化，得到

模糊綜合評判的結(jié)果可表明酒樣綜合質(zhì)量的優(yōu)劣，從模型的結(jié)果可以得出發(fā)酵余甘子酒的酵母菌株優(yōu)劣順序依次為EC1118、Aroma white、Perlage、D254和Top15。這與感官評定的結(jié)果一致，表明利用該模型結(jié)合感官評分更具有客觀性與說服力。

3 結(jié)論與討論

酵母是釀造果酒的關(guān)鍵因素之一，不同酵母在糖酵解過程因其酶活的差異導(dǎo)致了代謝糖、酸、甘油及香氣成分的差異[23]。鄭嬌等[13]研究了3 種不同酵母菌株對海紅果酒的理化性質(zhì)及香氣成分進(jìn)行了研究，結(jié)果表明酵母ICV254 的所得發(fā)酵酒的酒精度高、殘?zhí)橇康汀⑺岫鹊?、感官評分好，同時(shí)香氣成分多；李雙石[24]研究了不同酵母對葡萄酒香氣成分的影響，結(jié)果表明不同酵母發(fā)酵葡萄酒樣中香氣成分的種類和含量均具有明顯差異。本研究通過對5 株酵母所釀制的余甘子酒的理化性質(zhì)進(jìn)行對比，Perlage 酵母的糖利用率低于其余4種酵母，EC1118釀制的酒樣其酒精度適中，甲醇、揮發(fā)酸較低。通過GC-MS 對5 種余甘子酒的揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析，共鑒定出47 種揮發(fā)性香氣成分，主要為醇類與酯類物質(zhì)。EC1118釀制的酒樣總香氣成分含量最高，為1 118.81μg/L。

主成分分析可以將錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系變量歸結(jié)為少數(shù)幾個(gè)綜合因子，其目的是為了簡化數(shù)據(jù)和揭示變量間的關(guān)系[25]。目前該方法已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于果酒香氣成分的分析中。黎星辰[26]、李凱[7]等采用主成分分析對分析不同商業(yè)釀酒酵母對果酒香氣成分進(jìn)行分析，均發(fā)現(xiàn)能有效地區(qū)分不同商業(yè)酵母。本試驗(yàn)采用主成分分析可將5種釀酒酵母有效的進(jìn)行區(qū)分。經(jīng)感官評價(jià)EC1118釀制的余甘子酒感官得分最高。將感官得分與揮發(fā)性香氣成分結(jié)合進(jìn)行模糊綜合評判，得出5種酵母菌株釀制的余甘子酒的優(yōu)劣順序依次為EC1118、Aroma white、Perlage、D254和Top15，與感官得分結(jié)果一致。綜合考慮，EC1118更適合作為釀制優(yōu)質(zhì)余甘子酒的發(fā)酵菌株。