權(quán)博文,吳 桐,劉 慶,高 晨,周紅兵,白迎春,*,石松利,*(.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院,內(nèi)蒙古包頭 04040;2.內(nèi)蒙古扎蘭屯職業(yè)學院,內(nèi)蒙古扎蘭屯 62650;3.包鋼集團第三職工醫(yī)院,內(nèi)蒙古包頭 04040)

肺纖維化(pulmonary fibrosis,PF)是一組以肺間質(zhì)彌漫性滲出浸潤和纖維化為主要病變的疾病,對人體危害極大,其發(fā)病初期無明顯病癥,但隨著病情發(fā)展會出現(xiàn)咳嗽、胸悶并產(chǎn)生呼吸不暢、氣喘等現(xiàn)象。臨床上稱其為間接性呼吸困難[1]。近些年來,肺纖維化的發(fā)病率越來越高,但是臨床上仍然缺乏較有效的治療手段和針對性藥物,而氧化應激和過度炎癥反應在其發(fā)生發(fā)展中起重要作用[2]。在尋找對肺纖維化有效的治療藥物中,中藥在治療肺纖維化中,效果明顯,毒副作用小[3-5],近年來中醫(yī)藥防治肺纖維化已成為肺科學界關(guān)注的重點[6-7],中醫(yī)對該病的認識與研究日趨成熟,發(fā)現(xiàn)了很多在臨床和實驗中對預防和治療肺纖維化有效的藥物[8-9]。

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)蒙名烏蘭布依勒斯,又名山櫻桃、土豆子等,是薔薇科扁桃屬的多年生木本植物,是北方重要的木本油料樹種之一[10-11],旱生落葉灌木,為蒙古高原特有的阿拉善荒漠種[12],屬于國家二級保護植物[13]。其種仁可代中藥郁李仁入藥,具有治療咽喉干燥、干咳及支氣管炎、陰虛便秘等功效[14]。蒙古扁桃種仁中含油脂類、不飽和脂肪酸等[15],以及一定的多糖、黃酮類和酚類化合物[11，16-17],具有抗氧化應激等作用[18]。為此本實驗對蒙古扁桃治療肺纖維化的作用機制進行探究。

本研究采用博萊霉素氣管內(nèi)注射建立SD大鼠肺纖維化模型,觀察蒙古扁桃對肺纖維化大鼠肺組織病理學改變、氧化應激和炎癥介質(zhì)的影響,探索蒙古扁桃對肺纖維化大鼠的保護作用及其相關(guān)機制,從而為其臨床應用于肺纖維化的防治提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

70只健康雄性SD大鼠 7～8周,體重(120±20) g,北大醫(yī)學部(實驗動物科學學院)，許可證號 SCXK(京)2017-0005;蒙古扁桃種仁 內(nèi)蒙古西北部及周邊省市;鹽酸博來霉素(批號:540402) 日本化藥株式會社;醋酸潑尼松片(強的松)(批號:160905) 浙江仙琚制藥股份有限公司;總蛋白定量測定試劑盒(批號:20170619)、MDA試劑盒(批號:20170625)、SOD試劑盒(批號:20170605) 南京建成生物工程研究所;mRNA提取試劑TRIzol Thermo Fisher Scientific公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific公司;qPCR試劑RealSYBR Mixture 康為世紀公司;PCR引物 寧夏科諾嘉華生物工程有限公司。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;全自動脫帽離心機 長沙鑫奧儀器;LEICA-TP1020生物組織自動脫水機、RM2235切片機、LEICA-EG1150C生物組織包埋機 德國徠卡公司;CX32顯微鏡 日本奧林巴斯公司;Tip頭、EP管、NanoDrop 2000微量分光光度計、Vlultifuge X1R高速冷凍離心機 美國賽默飛公司;7500型Real-time PCR儀 美國AB公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蒙古扁桃種仁不同極性部位的制備 取蒙古扁桃種仁,去外殼,研磨成粉末狀,用75%乙醇回流提取制備總提取物(2 h,70 ℃),料液比1∶10 g/mL。得到總提取物后用液液萃取的方法用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水,按 1∶2體積比萃取,每種溶劑萃取3次,分別減壓濃縮回收各溶劑得到各個部位溶劑提取物[19],蒸干以去除殘留試劑,各部位提取物得率分別為:石油醚部位56.68%、乙酸乙酯部位8.38%、正丁醇部位23.35%、水部位11.59%。

1.2.2 動物分組與給藥 根據(jù)正常成人所需的蒙古扁桃藥材種仁每天的最大用藥量9.0 g計算[20],考慮中藥藥效可能為不同成分聯(lián)合作用,將給藥劑量加大,蒙古扁桃藥材石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物均按照生藥量1.5 g/kg給藥。使用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液作為溶劑配制成蒙古扁桃藥材不同極性提取物藥液,4 ℃冰箱保存。70只SD大鼠飼養(yǎng)一周,按體重隨機分為7組,分別為假手術(shù)組、模型組、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水、陽性藥強的松組(1.5 g/kg)。

大鼠肺纖維化的造模方法參考文獻[21-22]。用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉,將大鼠仰臥放置,用繩子固定四肢,再固定大鼠口腔,將舌頭拉出,壓住舌腹,在額鏡下觀察,趁大鼠吸氣時,迅速將氣管插管。模型組(BLM組)和給藥組按5 mL/kg緩慢注入1 mg/mL博來霉素,假手術(shù)組按5 mL/kg緩慢注入生理鹽水,注射完成后立即搖晃旋轉(zhuǎn)大鼠,使藥液在肺內(nèi)均勻分散。

各組于造模24 h后灌胃給藥,每日1次,連續(xù)4周。造模同時給藥,蒙古扁桃藥材石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位提取物均按照生藥量1.5 g/kg給藥,按大鼠體重5 mL/kg灌胃給藥,模型組和假手術(shù)組按大鼠體重5 mL/kg灌胃生理鹽水,每天給藥1次,觀察大鼠活動情況及有無死亡現(xiàn)象,飲水、進食等。溫度為22～26 ℃,濕度為35%～50%。

1.2.3 標本采集 在實驗的第4周末次給藥。24 h后,稱量體重,腹腔注射10%水合氯醛,麻醉后,仰臥并固定,切開腹腔,腹主動脈取血,摘取肺、進行稱重,并計算肺系數(shù),肺系數(shù)(%)=肺濕重×100/體質(zhì)量。從左肺葉中部切取0.7 cm×0.5 cm×0.3 cm大小肺組織做HE、Masson染色;右肺制成10%肺組織勻漿,離心后取上清液,按試劑盒要求檢測肺組織勻漿中SOD活性及MDA的含量;所采血液置于4 ℃下,6000 r/min冷凍離心10 min,分離血清,檢測血清SOD、和MDA含量。

1.2.4 相關(guān)細胞因子mRNA表達 Real-time PCR法檢測 TGF-β1、Smad3和α-SMA mRNA表達。取肺組織80 mg,研磨并加入加1 mL TRIzol,研磨至組織與TRIzol充分溶解,提取上層RNA溶解物后測濃度。取總RNA 2 μg進行逆轉(zhuǎn)錄,反應條件為37 ℃反轉(zhuǎn)15 min,85 ℃ 5 s,合成cDNA。PCR引物序列如表1,PCR擴增反應條件為95 ℃預變性10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃退火延伸45 s后采集信號,重復40個循環(huán)。每個組別做3次定量檢測,并計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果由熒光定量分析軟件進行統(tǒng)計和計算,并生成相應的Excel原始數(shù)據(jù)文件。根據(jù)原始檢測結(jié)果,按照相對定量計算公式2-ΔΔCt計算相應實驗結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古扁桃藥材不同極性部位對肺系數(shù)的影響

表2結(jié)果顯示,與假手術(shù)組對比,模型組大鼠的肺系數(shù)極顯著升高(P<0.01);與模型組對比,蒙古扁桃藥材石油醚部位組、正丁醇部位組、水部位組均能顯著降低大鼠的肺指數(shù)(P<0.05),說明蒙古扁桃藥材石油醚部位、正丁醇部位水部位對肺水腫程度有明顯改善。

表2 蒙古扁桃藥材不同極性部位對大鼠肺系數(shù)的影響Table 2 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on lung coefficient coefficient of rats

2.2 蒙古扁桃藥材不同極性部位對肺纖維化大鼠肺病理組織學的影響

HE染色鏡下觀察所見:空白組大鼠肺組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰,肺泡間隔未見增厚;模型組大鼠肺組織肺泡間隔明顯增厚,肺泡結(jié)構(gòu)消失,有纖維灶形成;蒙古扁桃石油醚和正丁醇劑量組與強的松組肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺纖維化程度較模型組明顯減輕。HE病理切片見圖1。

圖1 蒙古扁桃藥材不同極性部位對肺纖維化大鼠肺病理組織學的影響(HE染色,×100)Fig.1 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on lung histopathology of rats pulmonary fibrosis(HE staining,×100)注:A:假手術(shù)組;B:模型組;C:蒙古扁桃石油醚部位提取物組;D:蒙古扁桃乙酸乙部位提取物組;E:蒙古扁桃正丁醇部位提取物組;F:蒙古扁桃水部位提取物組;G:強的松組；圖2同。

Masson染色鏡下觀察所見:假手術(shù)組為正常肺組織結(jié)構(gòu),僅小部分肺泡周圍或支氣管壁輕微增厚;模型組肺組織可見全視野纖維化改變;蒙古扁桃石油醚部位組和正丁醇部位組肺泡或支氣管壁中度增厚,部分肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞,有纖維灶形成,肺纖維化程度較模型組明顯減輕,Masson病理切片見圖2。

圖2 蒙古扁桃藥材不同極性部位對肺纖維化大鼠肺病理組織學的影響(Masoon染色,×100)Fig.2 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on lung histopathology of rats pulmonary fibrosis(Masson staining,×100)

2.3 蒙古扁桃藥材不同極性部位對血清、肺臟組織勻漿MDA、SOD的影響

表3、表4結(jié)果表明,與假手術(shù)組對比,模型組大鼠血清和肺組織中SOD含量極顯著下降,MDA含量極顯著增高(P<0.01);與模型組對比,蒙古扁桃藥材石油醚部位組和正丁醇部位組和強的松組能提高肺組織和血清SOD含量,蒙古扁桃藥材石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇組和強的松能降低血清與組織中MDA,存在顯著或極顯著差異,說明蒙古扁桃藥材石油醚部位和乙酸乙酯部位和正丁醇部位能夠減輕博來霉素誘導的氧化應激損傷,從而減輕肺纖維化。

表3 蒙古扁桃藥材不同極性部位對血清及肺組織中SOD的影響Table 3 Effects of different polar extracts of Amygdalusmongolica on serum SOD in rats with pulmonary fibrosis

表4 蒙古扁桃藥材不同極性部位對血清及肺組織中MDA的影響Table 4 Effects of different polar extracts of Amygdalusmongolica on serum MDA in rats with pulmonary fibrosis

2.4 蒙古扁桃藥材不同極性部位對肺纖維化大鼠TGF-β1/Smad信號傳導通路的影響

表5結(jié)果顯示,與假手術(shù)組相比,模型組肺組織TGF-β1、Smad3和α-SMA mRNA極顯著增高(P<0.01);與模型組相比,蒙古扁桃石油醚部位組TGF-β1極顯著降低(P<0.01),強的松組TGF-β1顯著降低(P<0.05),蒙古扁桃石油醚部位組和正丁醇部位組Smad3顯著降低(P<0.05),蒙古扁桃正丁醇部位組和強的松組α-SMA顯著降低(P<0.05)。表明蒙古扁桃石油醚部位和正丁醇部位能夠抑制肺組織氧化應激以及細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生與沉積。

表5 蒙古扁桃不同極性部位對肺纖維化大鼠TGF-β1/Smad信號傳導通路的影響Table 5 Effects of different polar extracts ofAmygdalus mongolica on TGF-β1/Smad of signaling pathway in rats with pulmonary fibrosis

3 討論與結(jié)論

氣管內(nèi)注射博來霉素誘導大鼠肺纖維化,其方法與人類特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化極其相似,有較高的參考價值,廣泛應用于科學研究工作中[23-24]。博來霉素是目前世界公認的致肺纖維化藥物,實驗證明其會導致大鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞、肺泡間隔增大、大量的炎細胞浸潤及成纖維細胞明顯增殖,同時TGF-β1/α-SMA表達明顯增高[25-26]。本實驗通過氣管內(nèi)注射博來霉素復制肺纖維化模型,結(jié)果通過Masson、HE、PCR實驗均驗證出模型組較空白組TGF-β1及α-SMA表達明顯高并具有顯著性差異,表明本實驗造模成功。

肺指數(shù)是反映肺組織炎癥和肺纖維化程度的指標之一。本研究結(jié)果顯示蒙古扁桃各組大鼠肺指數(shù)較模型組降低,表明蒙古扁桃可以修復肺組織損傷,最終逆轉(zhuǎn)大鼠肺纖維化。

氧化應激是指機體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多,超出了機體的清除能力,導致氧化/抗氧化失衡的一種狀態(tài)。氧化應激在肺纖維化發(fā)生發(fā)展中的重要作用已得到了人們的共識[27]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,其含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度。SOD是內(nèi)源性抗氧化酶,可清除自由基,保護細胞免受自由基的損傷,其活力的高低可反映機體清除氧自由基的能力。本研究結(jié)果顯示模型組肺組織SOD活性顯著降低,MDA含量顯著升高,表明大鼠體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡,肺纖維化大鼠體內(nèi)的活性氧(如羥自由基、過氧化氫等)致使肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞受損,從而導致大鼠肺組織損傷[28]。

TGF-β1是重要的致纖維化因子之一,通過促進下游纖維化相關(guān)靶基因過量表達,引起組織瘢痕，現(xiàn)已證實TGF-β1在體內(nèi)發(fā)揮促纖維化作用,其作用已得到肯定[21]。α-SMA是SMA中最主要的肌動蛋白微絲,是成肌纖維細胞(MF)的表型標志,MF是細胞外基質(zhì)(ECM)的主要來源,而ECM沉積增多是組織纖維化的特征。α-SMA作為平滑肌的特征性標記物,是成纖維細胞收縮表型的典型標志,可以反映平滑肌數(shù)量及收縮能力的改變,是平滑肌細胞收縮的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),它具有收縮能力及較強膠原合成能力,促進I型膠原的沉積,進而形成纖維化。α-SMA的表達與細胞的增殖呈正相關(guān)[29]。本研究顯示,PF模型大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁破壞,肺泡腔及間質(zhì)內(nèi)有炎癥細胞滲出,肺泡隔明顯增厚,可見大量膠原纖維增生、沉積蒙古扁桃治療后,大鼠肺部的炎癥明顯減輕,肺泡結(jié)構(gòu)較整,間質(zhì)膠原沉積減少,表明本方能夠改善PF異常的組織病理形態(tài)表現(xiàn)。通過觀察TGF-β1及其信號轉(zhuǎn)導通路的Smad2、Smad3、Smad7表達水平,說明蒙古扁桃可從mRNA和蛋白水平抑制TGF-β1、Smad3的表達,改善PF作用可能與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。

綜上所述,蒙古扁桃可抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展,其機制可能與增強抗氧化能力以及減輕炎癥反應有關(guān),在博萊霉素誘導大鼠肺纖維化過程中,TGF-β/Smad通路可上調(diào)相關(guān)基因表達,說明活化這條通路可能導致纖維化發(fā)生。TGFβ1的激活可使成纖維細胞中膠原過度分泌,影響肺纖維化形成進而上調(diào)基質(zhì)和其它結(jié)締組織大分子的表達促進纖維化進程。此外,TGF-β通路還可能通過激活EMT(上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition)的發(fā)生,導致肌成纖維細胞大量產(chǎn)生,達到促肺纖維化作用。這些作用機制的揭示為指導蒙古扁桃的開發(fā)及臨床用藥提供了可靠的藥理學依據(jù)。目前關(guān)于這條通路在肺纖維化中作用及相互間關(guān)系的研究還處于初步階段,其具體機制有待進一步確認及深入研究。