鐘 閏,吳思偉,何秀苗,龍 寒,禤金彩,劉紅全(廣西民族大學海洋與生物技術(shù)學院,廣西多糖材料與改性重點實驗室,廣西南寧 530007)

微藻是生活在淡水或鹽水中的原核或真核光合微生物,在水生生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用,因為它們負責全球約40%的光合作用[1]。鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina),亦被稱為杜氏鹽藻,是一種嗜鹽的綠色微藻,屬綠藻綱團藻目,比較常見于海鹽田。相關(guān)研究表明,杜氏鹽藻及其代謝產(chǎn)物具有多種生物學功能,包括抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、免疫調(diào)節(jié)[4-5]和抗炎活性[6],可廣泛應(yīng)用到功能性的食品中,具有非常高的研究價值[7]。

全球癌癥發(fā)病率和死亡率正在迅速增長[8]。盡管癌癥生物學和治療學取得了一定進展,但耐藥性仍然存在問題[9]。許多癌細胞對化療藥物表現(xiàn)出顯著耐藥性,市場上幾乎所有化療藥物都會引起嚴重的副作用[10]。因此,迫切需要新的無毒或副作用小的替代治療藥物[11]。在過去十年中,越來越多的證據(jù)表明,海洋生物提供廣泛的天然抗腫瘤化合物,可以作為抗腫瘤藥物[12]。海藻是海洋中最豐富的資源,其活性代謝產(chǎn)物如多糖和多糖-蛋白質(zhì)復合物具有抗腫瘤活性或可提高常規(guī)化療藥物的療效[13-14]。

目前有關(guān)DsEPS的抗腫瘤活性及其作用機制仍有待闡明。本實驗以人宮頸癌Hela細胞為靶細胞,研究DsEPS的抗腫瘤活性,通過轉(zhuǎn)錄組學分析闡明抗腫瘤與相關(guān)基因表達的關(guān)系,再通過構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)找到互作網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵節(jié)點對應(yīng)的hub基因,從而確定DsEPS可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜氏鹽藻 上海光語生物科技有限公司提供;Hela細胞、Vero細胞 本課題組保存;配制F/2培養(yǎng)基的藥品 均為國產(chǎn)分析純;胎牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT 深圳市康初源有限公司;二甲基亞砜(DMSO)、EDTA胰蛋白酶、青鏈霉素 北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑 Takara Bio。

HBS-1096A型酶標分析儀 南京德鐵實驗設(shè)備公司;EYELA型冷凍干燥機 上海愛朗儀器有限公司;HPS-250型人工氣候箱 哈爾濱東明醫(yī)療器械廠;TG150-WS型臺式高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;YRE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器公司。

1.2 微藻培養(yǎng)與胞外多糖提取

將微藻按照15%的接種量培養(yǎng)于含250 mL的F/2培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中。人工氣候箱的培養(yǎng)條件為光照強度3500 lux,暗光周期為12 h/12 h,培養(yǎng)溫度為(24±1) ℃,每日搖動3～4次。杜氏鹽藻胞外多糖(DsEPS)的提取方法參照Ishiguro等[15]略有改進。將進入穩(wěn)定期的藻懸液以8000 r/min離心10 min,收集上清液。用水浴溫度低于45 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮上清液,然后用陰離子交換樹脂純化胞外多糖。樣品經(jīng)超濾膜再濃縮后,冷凍干燥得到杜氏鹽藻胞外粗多糖。

1.3 細胞培養(yǎng)與抗腫瘤實驗

取出保存于液氮罐中的Hela細胞和Vero細胞,靜置于37 ℃的恒溫水浴鍋中解凍1 min,將解凍后的細胞移入培養(yǎng)瓶內(nèi),添加DMEM培養(yǎng)液,置于CO2培養(yǎng)箱中,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)2～3 d。

分別接種對數(shù)期的宮頸癌Hela細胞與普通Vero細胞于96孔板內(nèi),用含DsEPS的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)兩種細胞,使含DsEPS的的培養(yǎng)液濃度分別為0.1、0.5、1.0、10.0 mg/mL,每個濃度設(shè)置5個重復。選取96孔板其中一行做空白對照,即以不加多糖的DMEM培養(yǎng)液來培養(yǎng)細胞。加樣完成后振蕩均勻,于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)時間分別達到24、48、72 h時終止,并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。然后使用MTT比色法,測定細胞數(shù)量。Hela細胞與Vero細胞增殖抑制率計算公式如下:

細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組/空白組)×100

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

在Hela細胞表型實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用RNA-seq技術(shù)系統(tǒng)分析了DsEPS加入與否對Hela細胞轉(zhuǎn)錄組基因表達的影響。采用TRIzol(Invitrogen)法提取Hela細胞中的總RNA,再將樣品送往上海美吉生物制藥生物技術(shù)有限公司(中國上海)進行RNA純化、反轉(zhuǎn)錄、文庫構(gòu)建和測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,映射與轉(zhuǎn)錄本組裝

由測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)(圖像文件)首先將轉(zhuǎn)化為原始序列,即 Raw reads。使用軟件:SeqPrep(https://github.com/jstjohn/SeqPrep)和Sickle(https://github. com/najoshi/sickle)去除Raw reads中的空載、接頭和低質(zhì)量序列(未知堿基N≥10%),得到 Clean reads。Clean reads 運用FastQC軟件進行整體評估,包括:①堿基質(zhì)量分布統(tǒng)計;②堿基錯誤率分布統(tǒng)計;③A/T/G/C堿基含量分布統(tǒng)計。

使用TopHat(http://TopHat. cbcb. umd. edu/,version2.1.1)[16]軟件,將clean reads與具有定向模式的參考基因組分別對齊?；谒x參考基因組序列,使用StringTie軟件對Mapped Reads進行拼接,并與原有的基因組注釋信息進行比較,尋找原來未被注釋的轉(zhuǎn)錄區(qū),發(fā)掘該物種的新轉(zhuǎn)錄本和新基因,從而補充和完善原有的基因組注釋信息。

1.6 表達量分析與差異表達基因(DEGs)分析

基于表達矩陣,進行樣本間相關(guān)性分析,相關(guān)性分析有助于理解樣本間特別是生物學重復間的相關(guān)性,驗證實驗設(shè)計的合理性。

為了確定兩組樣本間的差異表達基因(DEGs),可以先使用軟件RSEM(http://deweylab. biostat. wisc. edu/rsem/)用于量化基因豐度[17]。后續(xù)由于本實驗有生物學重復,直接使用基于負二項分布的DESeq2軟件對raw counts進行分析,基于一定的標準化處理和篩選條件獲得比較組間表達差異的基因/轉(zhuǎn)錄本,默認參數(shù):p-adjust<0.05 & |log2FC|>=1。

1.7 GO功能注釋分類和KEGG富集分析

利用GO數(shù)據(jù)庫,針對選擇的差異表達基因可以按照它們參與的生物學過程、構(gòu)成細胞的組分,實現(xiàn)的分子功能等進行分類。使用軟件KOBAS 2.1.1(http://KOBAS.cbi.pku.edu.cn/download.php)進行了和KEGG富集和代謝途徑分析[18]。

1.8 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)和中心基因分析

為了進一步研究小球藻胞外多糖抗腫瘤的分子機制,使用生物在線數(shù)據(jù)庫工具(用于檢索相互作用基因的檢索工具,STRING,http://string-db.org)將所有DEG用于構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),確定并預測它們之間的相互作用[19]。綜合得分>0.7(高置信度得分)被認為是有意義的,然后使用Cytoscape軟件(版本3.7.2)將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化[20]。為了評估PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的重要性,在本研究中用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件用于節(jié)點的度中心計算[21-22]。

1.9 實時熒光定量PCR(qPCR)驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,從轉(zhuǎn)錄組測序鑒定到的在不同信號通路的13個差異表達基因,用Primer5軟件設(shè)計13對(包括1個內(nèi)參基因 GAPDH)熒光定量PCR引物,擴增長度為80～250 bp,引物序列見表1。提取的RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 鏈后,進行熒光定量PCR測定,用2-ΔΔCt法計算每個基因相對于GAPDH的相對表達,所有試驗均獨立操作至少三次,并進行歸一化處理,以保證實驗結(jié)果的可重復性。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 抗腫瘤活性結(jié)果

DsEPS對Hela細胞作用的濃度和時間結(jié)果如圖1所示。隨著DsEPS濃度的增加,DsEPS對Hela細胞的抑制越來越強,但在一定時間內(nèi)(72 h)隨著作用時間的延長,并沒有顯著提升胞外多糖對Hela細胞的抑制率。當DsEPS濃度低于1.0 mg/mL時,DsEPS對Hela細胞的抑制率低于50%,當濃度為1.0 mg/mL時,DsEPS對Hela細胞的抑制率高于50%,說明濃度為1.0 mg/mL時已經(jīng)達到IC50,且由圖2可知,此時對正常Vero細胞幾乎沒有抑制,說明該濃度對Hela細胞的抑制作用顯著(P<0.05)且對普通Vero細胞無毒副作用。

圖1 DsEPS對Hela 細胞作用的濃度與時效性Fig.1 Concentration and time effect of DsEPS solution on Hela cells

圖2 DsEPS對Vero細胞生長的影響Fig.2 The effect of DsEPS on the Vero cell growth

DsEPS對Hela細胞形態(tài)的影響如圖3所示。DsEPS明顯抑制Hela細胞的生長和繁殖。隨著濃度的增加,抑制作用也明顯增強。抗腫瘤活性試驗顯示細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,表現(xiàn)為細胞皺縮、形狀異常、折射率減弱、細胞-細胞連接減少、細胞間空泡增多、重復性下降。

圖3 DsEPS對Hela細胞形態(tài)的影響(100×)Fig.3 Morphologic changes of Hela cell with DsEPS(100×)注:Control:不加DsEPS培養(yǎng)的Hela細胞;A:DsEPS濃度為0.1 mg/mL時的Hela細胞;B:DsEPS濃度為0.5 mg/mL時的Hela細胞;C:DsEPS濃度為1.0 mg/mL時的Hela細胞。

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控,映射和轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果

對照組(Control)和試驗組(DsEPS)分別獲得大約5070萬和5710萬個Raw reads(表2)。對Raw reads進行質(zhì)控,去除空載、接頭和低質(zhì)量序列(未知堿基N≥10%)后,對照組和試驗組分別得到5020萬和5660萬的Clean reads。該結(jié)果表明經(jīng)過質(zhì)控后仍有很大比例(99.1%)的高質(zhì)量Clean reads可用于組裝和進一步的下游分析。

表2 質(zhì)控數(shù)據(jù)統(tǒng)計表Table 2 Quality control data statistics

Clean reads被映射到人類參考基因組,詳細的映射匯總在表3中?？偟膩碚f,對照組和Ds組的映射分別有96.95%和96.97%的reads可匹配到基因組中,其中唯一匹配的reads分別占93.8%和94.07%,表明兩組的基因表達水平都很高。

表3 比對結(jié)果統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of comparison results

使用StringTie軟件對每個樣本進行拼接,最終merge在一起,對拼接之后的結(jié)果的統(tǒng)計和展示如圖4所示。

圖4 不同轉(zhuǎn)錄本長度分布情況Fig.4 Length distribution of transcripts

2.3 樣品間相關(guān)性檢驗與DEGs分析

本實驗生物學重復樣本之間的相關(guān)性分析,一方面為了檢驗生物學重復之間的變異是否符合實驗設(shè)計的預期,另一方面為差異基因分析提供基本參考。相關(guān)系數(shù)越接近于1,表明基因/轉(zhuǎn)錄本在樣本間的表達量相似度越高,即樣本間相關(guān)性越好。如圖5所示,樣本間的相關(guān)系數(shù)值均在0.9以上,重復性優(yōu)秀。

圖5 樣本間相關(guān)性熱圖Fig.5 Correlation thermogram between samples

對照組和實驗組的差異基因表達分析表明,實驗組(DsEPS)相較于對照組有2032個基因顯著差異表達(P-adjust<0.05 & |log2FC|>=1),其中1132個基因表達上調(diào),900個基因表達下調(diào)(表4)。這些基因的功能包括細胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝,線粒體功能,細胞周期,分化和凋亡,蛋白質(zhì)氧化磷酸化和細胞信號,RNA功能,DNA修復和蛋白質(zhì)合成,以及其他一些代謝酶。

表4 表達量差異統(tǒng)計結(jié)果Table 4 Statistical results of expression differences

如圖6所示,火山圖中每個點代表一個特定的基因,左側(cè)深色點表示顯著上調(diào)的基因,右側(cè)淺色點表示顯著(P<0.05)下調(diào)的基因,灰色點為非顯著差異基因。將所有基因映射上去之后,可以獲知,在左邊的點為表達差異下調(diào)的基因,右邊的點為表達差異上調(diào)的基因,越靠左邊和上邊的點表達差異越顯著(P<0.05)。

圖6 Control_vs_DsEPS火山圖Fig.6 Control_vs_DsEPS volcano

2.4 GO功能注釋分類與KEGG富集分析

為探討DsEPS處理腫瘤Hela細胞引起基因表達改變的功能性后果,基于GO數(shù)據(jù)庫對2032 條DEGs進行GO功能注釋并對其分類。圖7顯示了62個的GO分類,由圖7可知，DEGs分別注釋到生物學過程(biological process)27個亞類、細胞成分(cellular component)19個亞類、分子功能(molecular function)16個亞類。在生物學過程中,注釋到該GO二級分類功能的基因或轉(zhuǎn)錄本數(shù)目排名前三的分別是細胞過程1427個,單一生物過程1338個,生物調(diào)節(jié)1019個。在細胞成分中,涉及細胞、細胞部分、細胞器的基因較多,分別為1466、1464和1197個。在分子功能中,涉及連接和催化活性的基因較多,分別為1370個和563個。

圖7 GO分類統(tǒng)計柱形圖Fig.7 GO classification statistical histogram注:縱坐標表示GO的二級分類術(shù)語,左方橫坐標表示包含在該二級分類中的基因或轉(zhuǎn)錄本占總數(shù)的百分比,右方橫坐標表示比對上該二級分類的基因/轉(zhuǎn)錄本數(shù)量,三個顏色表示三大分類。

在生物體內(nèi),基因相互協(xié)調(diào)以發(fā)揮生物學功能。路徑分析有助于更好地理解基因的生物學功能。通過路徑顯著性富集分析,確定了差異基因參與的生化代謝和信號轉(zhuǎn)導途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),治療組與對照組共有38條代謝途徑表達差異顯著(P<0.05),其中23條代謝途徑表達差異極顯著(P<0.01)。圖8顯示了KEGG 38條表達差異顯著的代謝途徑(P<0.05)。分別包含在KEGG代謝通路的4個分支中,其中,人類疾病(HD)7條,生物體系統(tǒng)(OS)17條,環(huán)境信息處理(EIP)10條,代謝(M)5條。許多信號轉(zhuǎn)導途徑被顯著豐富(P<0.05),包括腫瘤壞死因子信號途徑、MAPK信號途徑、細胞因子-細胞因子-受體相互作用、VEGF信號途徑、Ras信號途徑、PI3K-Akt信號通路和cAMP信號途徑。此外,細胞凋亡、細胞周期和代謝等生物過程調(diào)控在本研究中得到了顯著的豐富(P<0.05)。這些結(jié)果可為研究DsEPS對宮頸癌Hela細胞的影響提供重要信息。

圖8 KEGG富集柱形圖Fig.8 KEGG enrichment histogram注:橫坐標表示KEGG pathway,縱坐標表示富集的顯著性水平,對應(yīng)的是柱子的高度,其中,FDR越小,-lg(FDR)值越大,該KEGG pathway越顯著富集。不同顏色表示KEGG代謝通路的不同分支,分別是代謝(M),環(huán)境信息處理(EIP),生物體系統(tǒng)(OS),人類疾病(HD)。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

為了進一步研究DsEPS抑制腫瘤生長的分子機制和所有DEGs之間的相互作用關(guān)系,將2032條DEGs映射到STRING數(shù)據(jù)庫中,并選擇綜合得分大于0.7(高置信度)的驗證性相互作用構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。PPI網(wǎng)絡(luò)由161個節(jié)點組成(圖9)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中,包括含2個自由基S-腺苷蛋氨酸結(jié)構(gòu)域(RSAD2)、ISG15泛素樣修飾劑(ISG15)、干擾素誘導的四肽重復蛋白1(IFIT1)、MX動態(tài)蛋白樣GTPase 2(MX2),干擾素誘導蛋白與四肽重復序列2(IFIT2),2′-5′-寡腺苷酸合成酶樣(OASL),2′-5′-寡腺苷酸合成酶1(OAS1),Jun原癌基因(Jun),2′-5′-寡腺苷酸合成酶2(OAS2),XIAP相關(guān)因子1(XAF1)等10種蛋白質(zhì)。用Cytoscape軟件中的CytoHubba插件用于節(jié)點的度中心計算,這些蛋白與其他蛋白質(zhì)(節(jié)點度大于8)緊密相連,表明它們是互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(圖10),這些hub基因可能在DsEPS抑制腫瘤生長中起重要作用。hub基因及其對應(yīng)各種拓撲性質(zhì)如表5所示。

圖9 STRING交互網(wǎng)絡(luò)Fig.9 STRING interaction network

圖10 PPI互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點Fig.10 Key nodes in PPI interactive networks

表5 基因互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)統(tǒng)計表Table 5 Statistical table of gene interaction network

2.6 qPCR驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果并進一步分析具有重要抗癌作用的基因的表達模式,13個具有不同信號通路的基因,MAPK信號通路(TNF、PRKCA)、PI3K-AKT信號通路(PIK3AP1、JAK3)、TNF信號通路(JUN、MLKL、BCL3)、cAMP信號通路(ATP1B3、PPP1R1B)、Ras信號通路(ETS1,RAC3)和細胞因子-細胞因子-受體相互作用(CXCL8,IL11RA)中的基因進行實時熒光定量PCR。qPCR驗證結(jié)果如圖11所示,其表達趨勢與RNA-seq獲得的結(jié)果一致,表明RNA-seq數(shù)據(jù)可靠地反映了基因表達的變化。

根據(jù)RNA-seq和qPCR結(jié)果,DsEPS處理的Hela細胞中,TNF、PIK3AP1、CXCL8、JUN、ATP1B3和ETS1的表達增加,而PRKCA、JAK3、IL11RA、MLKL、BCL3、PPP1R1B和RAC3等其他基因的表達顯著(P<0.05)降低。

圖11 DEG的qPCR驗證Fig.11 qPCR validation of DEG

3 討論與結(jié)論

本研究表明,杜氏鹽藻胞外多糖(DsEPS)具有抑制Hela細胞生長、促進Hela細胞凋亡的作用。在此條件下進行了生物信息學分析,以探索與抗腫瘤相關(guān)的潛在關(guān)鍵DEG和涉及DEGs的生物學功能和途徑。通過構(gòu)建PPI,確定了一些可能在實驗性腫瘤細胞抑制中起決定性作用的關(guān)鍵節(jié)點的hub基因。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示DsEPS共篩選出2032個DEGs,其中上調(diào)的1132個,下調(diào)的900個。腫瘤細胞的凋亡已經(jīng)被證明是許多癌癥療法誘導的最常見的抗腫瘤機制[23]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNFSF10/TRAIL)激活的TNFRSF10A的mRNA水平增加,從而轉(zhuǎn)導細胞死亡信號并誘導細胞凋亡[24]。BMF和BCL-2表達水平降低,這與抑制細胞凋亡有關(guān)。DsEPS對這些基因有明顯的調(diào)控作用,誘導細胞凋亡是其抗腫瘤作用的主要原因。下調(diào)的DEGs主要參與細胞代謝、有絲分裂和分化等功能。如甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)、成纖維細胞生長因子受體樣1(FGFRL1)。此外,與細胞遷移和侵襲相關(guān)的基因,如遷移和侵襲增強因子1(MIEN1)[25]、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBP1)也被下調(diào)。Gao等結(jié)果表明SREBP1通過促進與p65磷酸化相關(guān)的基質(zhì)金屬肽酶7(MMP7)的表達而促進大腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[26]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP7和SREBP1的基因表達顯著下調(diào),提示CEPS可能通過抑制SREBP1而影響腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

PI3K-Akt信號通路在人類腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及隨后的生長、增殖和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用[27]。大量研究表明,PI3K-Akt信號通路在多種癌癥中異常激活[28]。這種途徑的抑制劑被認為是潛在的候選藥物,其中一些處于臨床試驗的不同階段[29-30]。在人類癌癥中,抗凋亡的BCL-2蛋白在保護細胞免受不可逆轉(zhuǎn)的細胞死亡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[31]。本研究提示DsEPS可能通過抑制PI3K-Akt信號蛋白的表達下調(diào)BCL-2基因,釋放其對細胞凋亡的抑制作用,從而使Hela細胞凋亡。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,可以觀察到一系列hub基因形成了一個局部網(wǎng)絡(luò),包括RSAD2、IFIT1、MX2、IFIT2、OASL、OAS1、OAS2、XAF1和ISG15,其中大多數(shù)DEGs與癌癥的發(fā)生有關(guān)。其中,OAS、OAS1和OAS2是OAS蛋白家族的成員。OAS蛋白由OAS1/2/3和OASL蛋白組成,是干擾素誘導的第一個阻礙病毒核酸翻譯的抗病毒蛋白[32]。HPV與Hela細胞之間的聯(lián)系已經(jīng)被清楚地建立起來,人們普遍認為Hela細胞的主要原因是慢性感染致癌的HPV[33]。然而,OAS家族成員在腫瘤發(fā)展過程中的作用并沒有得到很好的證實。此外,IFIT1和IFIT2兩個hub基因與干擾素刺激密切相關(guān)。IFIT2與一些關(guān)鍵的細胞功能有關(guān),如增殖和遷移[34]。John等識別干擾素刺激蛋白IFIT1作為炎癥基因程序的負調(diào)控因子,并確定IFIT1在I型干擾素表達中的正調(diào)控作用[35]。JUN被廣泛認為是一種癌基因,它是激活蛋白-1(AP-1)復合物中研究最廣泛的蛋白質(zhì),參與多種細胞活動,包括增殖、遷移和腫瘤進展[36]。另一方面,c-Jun-NH2終末激酶(JNK)/c-Jun通路是癌細胞中重要的促凋亡信號通路。在目前的研究中,DsEPS處理的Hela細胞Jun顯著增加。然而,沒有證據(jù)表明DsEPS與這些中樞基因之間的關(guān)系。所以會進一步研究DsEPS在控制這些中樞基因及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。