馬東麗，石玉星，張寶俊，任 璐

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，山西太谷030801）

從植物中發(fā)掘具有抑制病原物生長或增強植物抗病能力的植物內(nèi)生菌是新農(nóng)藥研究和創(chuàng)制的方向之一。其中，植物中的內(nèi)生細菌已在多種植物的不同組織中被分離篩選出來，并且是迄今為止發(fā)現(xiàn)的相對豐富的生防資源，其制劑不僅降低了化學(xué)農(nóng)藥用量，還緩解了化學(xué)農(nóng)藥帶來的負面問題，對綠色和低毒化農(nóng)藥的發(fā)展具有重要意義。已有研究顯示，一些內(nèi)生細菌在植物病害的生物防治上具有良好的效果[1-3]。ARIMA 等[4]研究報道，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）可抗菌、抗病毒；PAPAVIZAS[5]和 HWAGNG 等[6]報道了利用（Bacillus subtilis）可防治多種土傳真菌病害。

隨著對植物內(nèi)生細菌認識的不斷加深，其分離源也不斷擴大。目前，已報道的植物分離源主要有藥用雜草、糧食作物、藥用樹木、蔬菜等陸生植物。另外，近年來隨著生物保鮮領(lǐng)域的發(fā)展，其分離源也擴大到采后海生植物、果蔬及種子[7-9]。從不同植物中分離到的內(nèi)生菌能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，其可以抑制或殺死植物病原菌，從而增強植物的抗病性[10-12]，或者植物內(nèi)生細菌還可通過競爭營養(yǎng)物質(zhì)等方式來誘導(dǎo)植物抗病性的產(chǎn)生[13]。水稻、玉米等多種植物內(nèi)生菌已被廣泛應(yīng)用于植物病害的生物防治[14-15]。

曼陀羅（Datura stramonium）是茄科曼陀羅屬野生、直立、木質(zhì)的1 年生大型草本植物，普遍生長于溫帶、熱帶地區(qū)，并且在全國各地廣泛分布[16]。曼陀羅中所含的生物堿對多種疾病的治療研究在病理方面已取得重大成果[17]。周靜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，曼陀羅提取物對菜青蟲和黏蟲均具有觸殺和拒食作用。但目前尚未見曼陀羅內(nèi)生菌對植物病原真菌具有拮抗作用的相關(guān)報道。

本研究從曼陀羅中篩選出1 株對多種植物病原真菌具有良好抑制作用的內(nèi)生細菌，并對其殺菌譜、分類地位及防治效果進行研究，以期為利用拮抗內(nèi)生細菌進行植物病害的生物防治奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物材料均是摘取健康無傷的組織，裝入無菌樣品袋中，帶回實驗室即刻進行內(nèi)生菌分離。植物組織包括檉樹莖，番茄根、莖、葉，花椒果實，葡萄莖、葉，辣椒根、莖、葉，曼陀羅葉、花，醉魚草根、莖、葉。

供試植物病原真菌為菜豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），菜豆炭疽病菌（Colletotrichum lindemuthianum），番茄灰霉病菌（Bortytis cinerea），番茄早疫病菌（Alternaria solani），谷瘟病菌（Pyricularia grisea），黃瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea），胡蘿卜褐腐病菌（Leptosphaeria libanotis），核桃腐爛病菌（Monilinia laxa），辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporium），棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani），蘋果腐爛病菌（Valsa mali），桃褐腐病菌（Monilinia fructicola），西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum），小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum），均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護實驗室保存提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物內(nèi)生細菌的分離 采用裴淑蘭等[19]的方法進行內(nèi)生細菌的分離。分別對不同植物的根、莖、葉和果實進行無菌水超聲波清洗，晾干后切成適合的小塊；依次浸泡于75%乙醇2 min、3%次氯酸鈉30 s、75%乙醇30 s，每次浸泡后均用無菌水沖洗3 次；后放入無菌研缽中，加入10 mL 無菌水，研碎后取汁液稀釋后涂布于NA 平板培養(yǎng)基上，每濃度3 次重復(fù)，30 ℃下培養(yǎng)3～7 d；待平板內(nèi)長出菌落后，根據(jù)菌落顏色、大小、突起特征等挑取形態(tài)差異較明顯的菌落，用平板劃線法轉(zhuǎn)接于空白NA 平板，對新長出的菌落再劃線分離2～3 次，獲得純培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接于NA 斜面，于4 ℃保存。

1.2.2 內(nèi)生拮抗細菌的篩選

1.2.2.1 初篩 經(jīng)預(yù)試驗選取Pyricularia grisea 為靶標(biāo)菌，采用謝宗華等[20]的四點平板對峙法篩選出拮抗菌株。用直徑5 mm 的打孔器在已培養(yǎng)5 d 的Pyricularia grisea 病菌菌落邊緣取菌餅，并接種在PDA 平板中央，然后接種已分離純化的供試內(nèi)生細菌于四周20 mm 處；對照組僅接種Pyricularia grisea，每處理重復(fù)3 次。在28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d 后，觀察是否有抑菌帶產(chǎn)生，并測定抑菌帶大小，計算抑制率。

1.2.2.2 復(fù)篩 以Pyricularia grisea 為靶標(biāo)菌，通過生長速率法進行復(fù)篩。將分離純化后的內(nèi)生細菌接種到LB 培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min 下振蕩培養(yǎng)72h；終止發(fā)酵后，在 4℃、12000r/min 下離心 10min，棄去菌體，收集上清發(fā)酵液，并通過0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到發(fā)酵濾液；將發(fā)酵濾液和PDA 培養(yǎng)基按1∶9（V∶V）比例均勻混合，以制備平板；待平板培養(yǎng)基固化后接入Pyricularia grisea 菌餅，并在26.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，以空白PDA 僅接種Pyricularia grisea 為對照，每處理進行3 次重復(fù)，培養(yǎng)7 d 后，通過十字交叉法測定菌落直徑，計算抑制率。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 內(nèi)生拮抗細菌MY1 抑菌譜測定

1.3.1.1 菌株MY1 抑菌活性測定 采用1.2.2.1 的平板對峙法，測定菌株MY1 對多種供試病原真菌的抑制率。

1.3.1.2 菌株MY1 代謝物抑菌活性的測定 采用1.2.2.2 的生長速率法，測定菌株MY1 的發(fā)酵液對多種供試病原真菌的抑制率。對制得的發(fā)酵液分別進行2 種處理：一種是通過0.22 μm 微孔濾膜過濾；另一種是在高溫滅菌鍋121 ℃滅菌30 min；以2 種方式處理的發(fā)酵液和PDA 培養(yǎng)基按1∶9（V∶V）的比例混合均勻以制備平板。采用生長速率法分別測定對14 種病原菌的抑制活性；培養(yǎng)3～7 d 后測定各個菌落直徑，計算抑制率。

1.3.2 菌株MY1 鑒定 將菌株MY1 點接于NA 培養(yǎng)基上，26.5 ℃活化培養(yǎng)24 h 后，用肉眼直接觀察菌落的顏色、光澤、質(zhì)地、邊緣情況、表面情況、透明度等形態(tài)特征；用掃描電鏡觀察內(nèi)生細菌MY1 的菌體、芽孢形態(tài)及大小。

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]對菌株MY1的生理生化特征進行鑒定。將菌株MY1 的16SrDNA序列（測序由寶生物工程（大連）有限公司完成）與GenBank 中序列進行BLAST 比對，選擇與之有高度同源性的菌株基因序列，使用MEGA 5.05 軟件分析并構(gòu)建菌株MY1 的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌株MY1 防效測定

1.3.3.1 預(yù)防效果測定 選取5、6 葉期長勢一致的番茄幼苗，在葉片分別噴灑MY1 發(fā)酵液原液、5 倍、10 倍、20 倍、50 倍、100 倍稀釋液以及對照藥劑腐霉利（50%WP）和清水對照。待自然晾干后，接種灰霉病菌和早疫病菌菌餅（直徑5 mm），置于24 ℃、95%相對濕度下培養(yǎng)3 d，后采用十字交叉法測定每片葉片的病斑直徑，計算防治效果。每處理10 株，每株調(diào)查5 片葉片。

1.3.3.2 治療效果測定 在葉片上接種灰霉病菌和早疫病菌菌餅，24 h 后噴灑1.3.3.1 各處理液；后置于24 ℃、95%相對濕度條件下培養(yǎng)3 d，測定每片葉片的病斑直徑，計算防治效果。每處理10 株，每株調(diào)查5 片葉片。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物內(nèi)生細菌的分離及篩選

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、濕潤度等特征，分別從不同植物組織中分離得到87 株拮抗細菌，其中，根部23 株、莖部 25 株、葉部 30 株、果實部 9 株，葉部分離到的拮抗細菌最多，占34.5%。

隨機選擇17 株內(nèi)生細菌菌株進行初步篩選，17 株拮抗細菌均對Pyricularia grisea 具有一定的抑制作用，且抑制率在45.36%～69.17%，其中，菌株MY1 對Pyricularia grisea 的抑制率最高。

測定了17 株內(nèi)生細菌發(fā)酵液的抑菌活性，抑制率在16.93%～91.33%，其中，菌株ZJ1 和MY1發(fā)酵液對Pyricularia grisea 的抑菌率較高，分別達到91.33%和90.6%?？梢赃x擇菌株ZJ1、MY1 進行后續(xù)研究，本研究選擇曼陀羅內(nèi)生細菌MY1 進行鑒定及抑菌譜的測定。

2.2 內(nèi)生拮抗細菌MY1 抑菌譜測定結(jié)果

2.2.1 菌株MY1 抑菌活性測定 試驗結(jié)果表明，菌株MY1 對供試病原真菌具有一定的抑制作用，抑制率在50.06%～100%（表1），其中，對桃褐腐病菌和谷瘟病菌的抑制率較高，分別達到98.95%和92.65%；對于菜豆炭疽病菌的抑菌效果較差，抑制率為50.06%；對其他病原真菌的抑制率在59.56%～76.86%。抑菌效果如圖1 所示。

表1 菌株MY1 對14 種病原真菌的抑制作用

2.2.2 菌株MY1 發(fā)酵液抑菌活性測定結(jié)果 對發(fā)酵液過微孔濾膜后，MY1 發(fā)酵液對14 種病原真菌的抑制率在76.65%～100%（表2），其中，抑制率在95%以上的有桃褐腐病菌、谷瘟病菌、黃瓜灰霉病菌、蘋果腐爛病菌、核桃腐爛病菌5 種病原真菌；抑制率在90%～95%的有4 種、80%～90%的有3 種、在75%～80%的有2 種。經(jīng)高溫處理后，對14 種病原真菌的抑制率僅有2.54%～49.85%，其中，僅對黃瓜灰霉病菌和谷瘟病菌的的抑制率在45%以上；抑制率低于20%的有9 種、介于25%～45%的有3 種，抑菌作用較過微孔濾膜處理明顯減弱。抑菌效果如圖2 所示。

表2 菌株MY1 發(fā)酵液對14 種病原真菌的抑制率分析 %

2.3 內(nèi)生細菌MY1 的鑒定

2.3.1 菌落形態(tài)特征觀察 曼陀羅內(nèi)生菌MY1 培養(yǎng)性狀：菌落為米白色，邊緣裂葉狀，表面干燥且不透明（圖3），表明菌株MY1 與芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）較為相似；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MY1 菌株菌體呈桿狀，周生鞭毛，大小為（0.5～1.5）μm×（1.5～2.0）μm（圖 4）。

2.3.2 生理生化鑒定 對菌株MY1 各項生理生化指標(biāo)進行鑒定，生理生化檢測結(jié)果表明，菌株MY1可以利用檸檬酸鹽與接觸酶反應(yīng)，并可以發(fā)酵葡萄糖，甲基紅試驗呈陰性，V-P 測定呈陽性，并且可水解淀粉和纖維素，硝酸鹽還原呈陽性，亞硝酸還原呈陰性，吲哚試驗呈陰性，可使明膠部分液化，可產(chǎn)生硫化氫，并且可氧化乙醇和乙酸。該菌株可耐受4、20、30、37、41、45、65 ℃的環(huán)境，可以在含有 2%～10%的NaCl 培養(yǎng)液中生長，對甘露醇、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖5 種碳源均有較好的利用率。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征，菌株MY1 初步被鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株MY1 16S rDNA 全序列解析，獲得序列長度為1 427 bp，測序后的序列上傳至GenBank（登錄號為MN055702）；將16S rDNA 序列與GenBank 中登錄相似的16S rDNA 序列進行比對，選取具有較高同源性的菌株基因序列，使用MEGA 5.05 軟件進行分析，并采用Neighbor-Joining 法構(gòu)建MY1 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示（圖 5），MY1 菌株與 Bacillus methylotrophicus 聚于同一分支，同源性達到100%，具有較高的親緣關(guān)系。綜合形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，初步將菌株MY1 確定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌。

2.4 內(nèi)生拮抗細菌MY1 防治效果測定

菌株MY1 發(fā)酵液原液及各稀釋倍數(shù)發(fā)酵液均對番茄灰霉病和番茄早疫病具有一定的預(yù)防和治療效果（表3），其中，發(fā)酵液原液及5～50 倍發(fā)酵液稀釋液對灰霉病和早疫病的防治效果均超過60%，其中，5 倍稀釋發(fā)酵液的預(yù)防和治療效果最好，對灰霉病分別達到86.4%和80.2%，對早疫病分別達到88.9%和82.6%，且與50%腐霉利WP 對照藥劑的預(yù)防和治療效果間沒有顯著差異；發(fā)酵液原液的防治效果低于5 倍稀釋發(fā)酵液和對照藥劑，且預(yù)防效果高于治療效果。

表3 發(fā)酵液對盆栽番茄灰霉病和早疫病的防治效果 %

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生細菌是一種生防資源，其分布廣、種類多、存在于絕大多數(shù)植物中，在生物防治中具有重要意義[22]。許多野生植物由于生長時間長、抗逆性強、生長環(huán)境復(fù)雜等特性，成為篩選內(nèi)生細菌的有利植物資源[23]。本研究從檉樹、番茄、花椒、葡萄、曼陀羅和醉魚草等植物的不同組織中共分離得到87 株內(nèi)生細菌，根、莖、葉和果實中均可以分離得到，通過生長速率法篩選發(fā)現(xiàn)，對谷瘟病菌抑制作用高于80%的內(nèi)生細菌有7 株，其中5 株來源于野生草本植物，且從草本植物莖和葉中分離的內(nèi)生細菌數(shù)量高于根部，這與林木組織中內(nèi)生細菌分布以根部最多存在差異[24]，其原因還有待進一步研究。

本研究測定曼陀羅內(nèi)生細菌MY1 的抑菌譜發(fā)現(xiàn)，該菌株抑菌譜較廣，特別對桃褐腐病菌和桃褐腐病菌抑制率高達90%以上，且發(fā)酵液抑菌活性高于活菌菌體。該菌株的抑菌活性同已報道的多株植物內(nèi)生細菌相比具有更高的抑菌活性[25-27]，說明菌株MY1 在植物病害防治中具有良好的應(yīng)用潛力。今后還需進一步進行室內(nèi)盆栽試驗及田間防效研究。

《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]從形態(tài)學(xué)及生理生化的角度為細菌鑒定提供了參考，并對植物內(nèi)生細菌的種類進行了大致的分類，但是，由于同屬內(nèi)生細菌或近緣內(nèi)生細菌的形態(tài)特征和生理生化特征較為接近，因此，僅憑這些特征很難對種別進行判定。近年來，16S rDNA 序列分析已被廣泛應(yīng)用于細菌鑒定和系統(tǒng)分類研究，以有效區(qū)分無法依靠形態(tài)及生理生化特性區(qū)分的菌株，這是一種常用且較為準(zhǔn)確的細菌鑒定方法。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定以及16S rDNA 序列分析方法，將菌株MY1 鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）。但是這3 種手段的聯(lián)合使用對于一些近緣種依然較難準(zhǔn)確鑒定，由于序列間的相似度太高，16S rDNA 基因序列分析往往容易失效[23，28]，如區(qū)分枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。因此，可以進一步加入一些特異基因（如芽孢桿菌中的gyrA 和gyrB），從而更加準(zhǔn)確地確定其分類地位[29]。

本研究表明，菌株MY1 發(fā)酵液對番茄灰霉病和早疫病具有較好的防治效果，推測該菌株主要是通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)發(fā)揮作用。室內(nèi)盆栽防效同已報道的多株生防內(nèi)生細菌相比較相似[30-33]。但由于菌株本身、番茄品種、試驗條件以及處理方式和處理時間的不同，防效略有差異，且不同來源菌株和不同種菌株，在植物病害的防治上存在一定差異，還需進一步加強其定殖特性和田間防效的研究。

本研究對菌株MY1 的抑菌特性和分類地位進行了探討，除此之外，關(guān)于甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌生物防治的研究報道還包括生防機制研究、可濕性粉劑制備和乳懸劑制備等[34-36]，今后將繼續(xù)進行菌株MY1 抑菌物質(zhì)的鑒定及抑菌機制的探索，并進行生防菌劑的制備，以期明確其生防機制和田間應(yīng)用價值，為微生物農(nóng)藥的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。