單張凡

（江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，江西南昌 330045）

長穗偃麥草是小麥遠緣雜交利用最廣泛和成功的小麥近緣物種之一，在小麥育種和生產(chǎn)中作出重大貢獻［1］二倍體長穗偃麥草具有抗炎、抗旱等優(yōu)秀性狀，因而人們較早地開展了小麥與長穗偃麥草的遠緣雜交和回交轉(zhuǎn)育工作，相繼育成了一套完整的小麥-長穗偃麥草二體附加系和代換系［2］，本試驗通過DNA提取、PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳法等方法，對長穗偃麥草雜交的幾個組合小麥進行了檢測，檢測其抗白粉病基因，并驗證了方法的準確度和重現(xiàn)性，以期后續(xù)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料本試驗所采用的實驗材料均由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所提供，具體組合為新春37∕XC（長穗偃麥草雜交后代）10、新春37∕XC31、新春37∕XC35

1.2 試驗步驟

1.2.1 播種 組合新春37∕XC10取63粒種子、新春37∕XC31取15粒、新春37∕XC35取22粒播種，取5×10的培養(yǎng)盤2盒，在培養(yǎng)盤中放入由農(nóng)場土、肥料土和較為松軟的營養(yǎng)土混合而成的土，撥平土面，將種子從格子中間壓入土中。然后將其轉(zhuǎn)移至溫室，定期澆水。

1.2.2 DNA檢測溶液的配制 取樣：在小麥1葉1心期進行取樣。取2g左右小麥的葉片，放入2mL的離心管中，將離心管放入液氮罐中防止葉片失活。

磨樣：將裝有小麥樣品的離心管從液氮罐中撈出來并迅速放入磨樣機粉碎。

DNA提?。簩⒁呀?jīng)研磨至粉末狀的樣品撈出，加入0.8mL裂解液（1%SLS裂解液），劇烈振蕩，充分混勻，于室溫 靜 置10min；加 入0.8mL 的CTAB 提 取 液，室 溫 靜 置10min，12000rpm離心10min后，將上清液移至1.5mL離心管中，重復此操作1次；加入上清液0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，充分混勻，-20℃沉淀30min；4℃10000rpm離心10min，棄上清，加入1mL75%乙醇洗滌沉淀2 遍，每次4℃10000rpm離心5min后棄上清，第3遍用無水乙醇洗滌，離心后棄上清，在超凈工作臺吹干；向干燥的DNA中加入TE緩沖液，溶解DNA.得DNA提取液

DNA提取液濃度檢測：使用NanoDrop1000微量紫外-分光光度計測定樣品液的純度及質(zhì)量濃度。打開Nano?Drop軟件，設(shè)計Type為DNA，加入1μL DNA提取液進行測定，得出DNA濃度、260∕280、260∕230數(shù)值。DNA濃度范圍應(yīng)為100ng∕ul左右，若過大，則應(yīng)加入TE緩沖液進行稀釋；260∕280數(shù)值應(yīng)在1.9左右；260∕230數(shù)值不得小于2.0。

1.2.3 PCR擴增 PCR體系的構(gòu)建：在離心管中分別加入154.8μL Mix、3.6μL ThpF、3.6μL ThpR，混合離心，在96孔板中先加入1.5μL 檢測后的DNA，取13.5ul離心后的溶液，封口，放入PCR儀中。

PCR擴增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s；根據(jù)不同的引物設(shè)置不同的退火溫度，退火15s；60℃延伸30s；最后72℃延伸7min的擴增后的溶液。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測 凝膠的配制：稱取2.5g瓊脂糖粉置于250mL的錐形瓶中，加入100mL TAE溶液，將錐形瓶置于微波爐中中火加熱，搖晃后再次置于微波爐中加熱進行消泡后，加入5μ LEB染液混合均勻，倒入實現(xiàn)準備好的膠盒中，并放好梳子，靜置10min后小心地垂直拔出梳子。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：取出已成的膠體，放于電泳槽中，將經(jīng)PCR擴增后的DNA溶液小心加入點樣孔，蓋上蓋子，然后啟動電泳儀，在140V的電壓下等待20min后取出膠體，放在凝膠成像分析系統(tǒng)中進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種組合的檢測結(jié)果利用引物Thp51、Thp43、Thp7、Thp34分別構(gòu)建不同的PCR體系，并利用瓊脂糖凝膠電泳法對新春37∕XC10、新春37∕XC31、新春37∕XC35進行檢測。不同引物和退火溫度對3種組合的檢測結(jié)果見圖1～4。由圖1～4可見：不管是哪一種PCR體系，這幾個組合的擴增結(jié)果并沒有發(fā)生改變，均只有新春37∕XC31、新春37∕XC35的部分幼苗跑出了與長穗偃麥草相同的亮帶，說明這些擁有與長穗偃麥草相同亮帶的品種中導入了長穗偃麥草的基因，且此方法準確度較高。

2.2 方法重現(xiàn)性的驗證采用引物Thp51，退火溫度58.4對新春37∕XC31和新春37∕XC35的幼苗進行重復3次進行測定，檢測結(jié)果見圖5～7。

由圖5結(jié)果可見：采用相同的引物相同的退火溫度，對樣品進行連續(xù)3次的檢測，能跑出亮帶的品種類型一致，該方法的重現(xiàn)性較高。

3 結(jié)論與討論

長穗偃麥草是普通小麥的野生近緣種，其基因組DNA序列與小麥具有很高的同源性［3］，本試驗結(jié)果表明，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測3個組合中導入的長穗偃麥草基因。瓊脂糖凝膠電泳法所取的樣品為小麥的葉片，取樣后并不影響小麥的正常生長，且可以重復取樣。該方法不僅重現(xiàn)性好，而且測得的結(jié)果較為穩(wěn)定，準確度高，亮帶明顯。由此可見，應(yīng)用這一技術(shù)，可以大規(guī)模篩選已導入某一基因的植株，檢驗小麥雜交成功與否。