陳 英，蘆志龍，張穗生，陳小玲，陸 琦，吳仁智，陳 東，關(guān) 妮**

(1.廣西科學(xué)院，國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，非糧生物質(zhì)酶解國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007；2.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530226)

0 引言

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株，在工業(yè)應(yīng)用中會(huì)面臨各種各樣的環(huán)境壓力。高糖環(huán)境是釀酒酵母在乙醇發(fā)酵過(guò)程中常遇到的一種壓力條件，篩選耐高糖釀酒酵母菌株，研究釀酒酵母耐高糖機(jī)制，了解耐高糖性狀與基因表達(dá)、調(diào)控的關(guān)系，對(duì)選育、改造優(yōu)良菌株和提高工業(yè)生產(chǎn)效率意義重大。Tup1基因是一個(gè)普遍抑制因子，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)釀酒酵母在不同環(huán)境下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)敲除Tup1基因后，明顯解抑制的基因不少于300個(gè)[1]。由4個(gè)Tup1和1個(gè)Ssn6亞基組成的Tup1-Ssn6復(fù)合體是最早被識(shí)別的共阻遏復(fù)合體之一[2，3]。釀酒酵母Tup1蛋白由713個(gè)氨基酸組成，從功能上分為3個(gè)蛋白-蛋白互作區(qū)域，不同區(qū)域參與不同基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[4]。Lin等[5]利用基因缺失研究Mig1、Tup1和Ssn6對(duì)酵母葡萄糖抑制作用的影響，發(fā)現(xiàn)Tup1基因與其他兩個(gè)基因不同，缺失后對(duì)酵母解除葡萄糖抑制麥芽糖利用的能力有負(fù)作用。Han等[6]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)糖酵解和糖原異生轉(zhuǎn)錄所需的3,5-二磷酸磷脂酰肌醇激酶受Tup1基因抑制。叢建國(guó)等[7]利用生物信息學(xué)研究Tup1基因網(wǎng)絡(luò)的非線性行為特征，基因缺失突變芯片數(shù)據(jù)顯示，Tup1對(duì)13號(hào)染色體上的基因是激活而不是抑制作用。Rizzo等[8]利用MNase-ChIP-chip法對(duì)釀酒酵母野生菌株和Tup1Δ菌株的核小體進(jìn)行測(cè)序分析，首次獲得Tup1蛋白在染色質(zhì)上的結(jié)合位置。最新研究發(fā)現(xiàn),Tup1基因參與白色念珠菌毒性相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控[9]，Rania等[10]發(fā)現(xiàn)Tup1基因表達(dá)量與新設(shè)計(jì)合成的抗白色念珠菌藥物SR的活性之間存在正相關(guān)性，為今后抑制白色念珠菌及其他依賴Tup1基因的真菌感染藥物設(shè)計(jì)提供參考。在前期研究中，本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)篩選獲得的耐高糖釀酒酵母突變菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[11]，PheNetic網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示,Tup1基因是突變菌株突變性狀的主要誘發(fā)因子之一，在互作網(wǎng)絡(luò)中直接或間接影響眾多其他基因。本研究通過(guò)測(cè)定Tup1基因缺失菌株在高糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和發(fā)酵情況，更準(zhǔn)確地了解Tup1基因?qū)︶劸平湍改透咛切誀畹挠绊?，為后續(xù)研究釀酒酵母耐高糖機(jī)制和釀酒酵母菌株改造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

SaccharomycescerevisiaeUV02_HG(以下簡(jiǎn)稱UV02_HG)為本研究團(tuán)隊(duì)以甘蔗糖廠廢棄物中篩選的釀酒酵母菌株為出發(fā)菌株紫外誘變獲得。SaccharomycescerevisiaeUV02_HGΔTup1(以下簡(jiǎn)稱UV02_HGΔTup1)為缺失Tup1基因的UV02_HG菌株。pUG6和pSH65質(zhì)粒保存于國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖(YPD)培養(yǎng)基：胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖2%，固體培養(yǎng)基添加2% 瓊脂粉；G418在液體培養(yǎng)基中的終濃度為200 μg/mL，在固體培養(yǎng)基中的終濃度為300 μg/mL； Zeocin的使用濃度為50 μg/mL。

葡萄糖梯度培養(yǎng)基：胰蛋白胨2%，酵母提取物1%，葡萄糖濃度梯度分別為20%(YP20)、30%(YP30)、40%(YP40)。

產(chǎn)孢培養(yǎng)基：酵母粉0.25%，葡萄糖0.1%，KCl 0.18%，NaAc 0.82%，瓊脂粉2%。

1.1.3 酶與試劑

PCR試劑、DNA marker、限制性內(nèi)切酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；Yeast extract，Trytone為OXOID產(chǎn)品；抗生素、SDS、EDTA、This·HCl、山梨醇購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；TTC為Sigma公司產(chǎn)品；Tris飽和酚為Solarbio公司產(chǎn)品；蝸牛酶購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)型號(hào)為蘇州凈化SW-CJ，PCR儀型號(hào)為Biometra Tpersonal P，分光光度計(jì)型號(hào)為Bechman coulter DU800，電轉(zhuǎn)化儀型號(hào)為BTX ECM630，顯微鏡型號(hào)為Nikon 80i，高效氣相色譜儀型號(hào)為Agilent 6890N，離心機(jī)型號(hào)為HETTICH Mimiko 200R，凝膠成像系統(tǒng)為Biometra。

1.2 方法

1.2.1Tup1基因敲除

釀酒酵母單倍體(MATa型和MATα型)細(xì)胞制備參照文獻(xiàn)[12]，陽(yáng)性重組子PCR驗(yàn)證參照文獻(xiàn)[13]，單倍體細(xì)胞雜交復(fù)倍及抗性消除參照文獻(xiàn)[14，15]。敲除組件擴(kuò)增引物名稱和序列見(jiàn)表1(小寫堿基是目的基因讀碼框兩側(cè)同源序列，大寫堿基是pUG6質(zhì)粒上loxP兩端序列)?；蛉笔Ь關(guān)CR驗(yàn)證引物見(jiàn)表2。

表1 擴(kuò)增敲除組件PCR引物Table 1 PCR primers of amplification of knockout components

表2 PCR驗(yàn)證引物Table 2 PCR primers of verification

1.2.2 不同濃度葡萄糖固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

計(jì)算活化的新鮮菌液細(xì)胞濃度，每株取約1×109個(gè)細(xì)胞離心收集菌體，用無(wú)菌水重懸，使細(xì)胞初始濃度為1×109cells/mL，再將濃度分別稀釋至1×108，1×107，1×106，1×105，1×104cells/mL，每個(gè)濃度吸取2 μL菌懸液，分別點(diǎn)到不同濃度葡萄糖固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)2 d，觀測(cè)菌株生長(zhǎng)情況。

1.2.3 測(cè)定YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

計(jì)算活化的新鮮菌液細(xì)胞濃度，每株取約1.5×107個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)接至5 mL YPD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(30°C，180 r/min)，每隔4 h取樣，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定各菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 測(cè)定YP40培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)和發(fā)酵曲線

計(jì)算活化的新鮮菌液細(xì)胞濃度，每株取約1.5×108個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)接至50 mL YP40培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)(30°C，200 r/min)，每隔4 h取樣，用細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定菌株的生長(zhǎng)曲線，氣相色譜測(cè)定乙醇發(fā)酵曲線。

1.2.5 測(cè)定細(xì)胞相對(duì)呼吸強(qiáng)度

參照文獻(xiàn)[16]，用2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC)法測(cè)定細(xì)胞的相對(duì)呼吸強(qiáng)度。按照1%(V/V)的接種量將活化的新鮮菌液接入5 mL YPD或YP40培養(yǎng)基中，30°C，180 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)離心收集菌體，轉(zhuǎn)接至10 mL YPD或YP40培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度至OD600=1.0，向菌液中加入TTC(終濃度為0.5 mg/mL)，30°C，180 r/min 培養(yǎng)6 h后取5 mL離心收集菌體，用1 mL 95%乙醇重懸，劇烈震蕩(約10 min)使細(xì)胞破壁，12 000 r/min離心10 min，測(cè)定上清液在480 nm下的吸光值，以出發(fā)菌株的呼吸強(qiáng)度為100%，根據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算每株菌的相對(duì)呼吸強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因缺失菌株P(guān)CR驗(yàn)證

以篩選的陽(yáng)性重組子DNA為模板，用Tup1-A、Kan-B、Kan-C、Tup1-D引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，如圖1所示，兩對(duì)引物在MATa型和MATα型單倍體DNA中分別擴(kuò)增到大小約為300 bp的片段，片段送測(cè)序公司測(cè)序后證實(shí)目的基因片段缺失成功。

2.2 基因缺失菌株性狀測(cè)定

通過(guò)PCR驗(yàn)證的單倍體基因缺失菌株，復(fù)倍和消抗后，進(jìn)行性狀測(cè)定。

2.2.1 不同濃度葡萄糖固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

如圖2所示，對(duì)不同濃度梯度細(xì)胞在固體培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)形成的菌落大小、菌落數(shù)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)基因缺失菌株UV02_HGΔTup1在YPD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不如出發(fā)菌株UV02_HG，在YP20、YP30和YP40培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況優(yōu)于出發(fā)菌株。說(shuō)明Tup1基因缺失后，釀酒酵母細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)受到抑制，但對(duì)高糖環(huán)境的適應(yīng)能力卻得到增強(qiáng)。

2.2.2 在YPD中的生長(zhǎng)曲線

如圖3所示，在YPD培養(yǎng)基上，基因缺失菌株UV02_HGΔTup1的生長(zhǎng)速率和最大細(xì)胞數(shù)都比出發(fā)菌株UV02_HG低，這與在YPD固體平板上的生長(zhǎng)情況一致，說(shuō)明Tup1基因的缺失影響了酵母細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。

圖3 菌株UV02_HG和UV02_HGΔTup1在YPD培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curves of strains UV02_HG and UV02_HGΔTup1 in medium of YPD

M.DL2000 DNA marker；1.MATa型，Tup1-A和Kan-B引物擴(kuò)增產(chǎn)物；2.MATa型，Kan-C和Tup1-D引物擴(kuò)增產(chǎn)物；3.MATα型，Tup1-A和Kan-B引物擴(kuò)增產(chǎn)物； 4.MATα型，Kan-C和Tup1-D引物擴(kuò)增產(chǎn)物M.DL2000 DNA marker，1.MATa type,product amplified by primers Tup1-A and Kan-B，2.MATa type,product amplified by primers Kan-C and Tup1-D，3.MATα type,product amplified by primers Tup1-A and Kan-B，4.MATα type,product amplified by primers Kan-C and Tup1-D圖1 PCR驗(yàn)證基因缺失Fig.1 PCR verification of gene missing

1.菌株UV02_HG，2.菌株UV02_HGΔTup11.Strain UV02_HG，2.Strain UV02_HGΔTup1

圖2 菌株UV02_HG和UV02_HGΔTup1在不同濃度葡萄糖培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況
Fig.2 Growth situation of strains UV02_HG and UV02_HGΔTup1in solid medium under different glucose concentration

2.2.3 在YP40中的生長(zhǎng)和發(fā)酵曲線

在YP40培養(yǎng)基中，基因缺失菌株UV02_HGΔTup1前期生長(zhǎng)速率高于出發(fā)菌株，28 h后生長(zhǎng)速率降低，最大細(xì)胞數(shù)為7.43×108cells/mL，略小于出發(fā)菌株的最大細(xì)胞數(shù)7.60×108cells/mL(圖4)。基因缺失菌株在YP40培養(yǎng)基中乙醇發(fā)酵能力也略優(yōu)于出發(fā)菌株，最高乙醇產(chǎn)率平均達(dá)15.30%(圖5)。

圖4 菌株UV02_HG和UV02_HGΔTup1在YP40培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curves of strains UV02_HG and UV02_HGΔTup1 in medium of YP40

圖5 UV02_HG和UV02_HGΔTup1在YP40培養(yǎng)基中的乙醇發(fā)酵曲線Fig.5 Ethanol fermentation curves of strains UV02_HG and UV02_HGΔTup1 in medium of YP40

2.2.4 相對(duì)呼吸強(qiáng)度檢測(cè)

用TTC法測(cè)定在YPD和YP40培養(yǎng)基中處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩菌株的呼吸強(qiáng)度，測(cè)定結(jié)果如圖6和7所示。在YPD培養(yǎng)基中，菌株UV02_HGΔTup1的呼吸強(qiáng)度是UV02_HG的20.0%，在YP40培養(yǎng)基中升高至88.2%。

圖6 菌株UV02_HG和UV02_HGΔTup1在YPD培養(yǎng)基中的相對(duì)呼吸強(qiáng)度Fig.6 Relative respiration intensity of strains UV02_HG and UV02_HGΔTup1 in medium of YPD

圖7 菌株UV02_HG和UV02_HGΔTup1在YP40培養(yǎng)基中的相對(duì)呼吸強(qiáng)度Fig.7 Relative respiration intensity of strains UV02_HG and UV02_HGΔTup1 in medium of YP40

3 討論

3.1 Tup1基因?qū)︶劸平湍改透咛切誀畹挠绊?/h3>

Tup1基因缺失后，菌株在YP40培養(yǎng)基中28 h前生長(zhǎng)速率較快，28 h后有所降低，發(fā)酵能力整體提高，這與呼吸強(qiáng)度降低是相符的，乙醇發(fā)酵后期，無(wú)氧環(huán)境更有利于乙醇產(chǎn)量提高[17]，說(shuō)明生長(zhǎng)后期菌株更偏向厭氧發(fā)酵。但該結(jié)果與之前研究中突變菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵能力提高，呼吸強(qiáng)度降低，Tup1基因表達(dá)量卻上調(diào)的結(jié)果[11]相比，存在矛盾。Green等[18]通過(guò)微列陣技術(shù)分析了野生釀酒酵母菌株和Tup1基因保守序列區(qū)5個(gè)定點(diǎn)突變體的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變體解抑制的對(duì)象不同，表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)量不等；又通過(guò)Suc2、Spi1、Hsp12這3個(gè)基因在Tup1Δ及5個(gè)定點(diǎn)突變體中表達(dá)量的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)Tup1Δ菌株比點(diǎn)突變的突變株解抑制作用更強(qiáng)?？梢?jiàn)，酵母細(xì)胞自身表達(dá)調(diào)控是一項(xiàng)牽一發(fā)而動(dòng)全身的精細(xì)工程，前期研究中的突變菌株是經(jīng)紫外誘變篩選獲得，Tup1基因表達(dá)量上調(diào)這一因素的影響可能被其他基因突變的作用抵消或覆蓋，本研究只對(duì)Tup1基因進(jìn)行缺失，影響因素相對(duì)單一，所以菌株性狀的改變與Tup1基因的缺失有直接關(guān)系，可見(jiàn)Tup1基因缺失對(duì)釀酒酵母耐高糖性狀有正向作用。

3.2 Tup1基因?qū)︶劸平湍负粑鼜?qiáng)度的影響

轉(zhuǎn)錄因子Tup1與Cyc8(Ssn6)形成復(fù)合體，正常生長(zhǎng)條件下參與釀酒酵母超過(guò)300個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，涉及多種代謝途徑，包括孢子形成及減數(shù)分裂、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、高滲應(yīng)激、葡萄糖代謝、淀粉及氧的利用、DNA修復(fù)等[19,20]。Wang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，Cyc8-Tup1復(fù)合體和Dbp2聯(lián)合作用抑制一系列基因表達(dá)，GO富集分析顯示這些基因主要集中在糖質(zhì)新生、細(xì)胞呼吸和對(duì)碳源的選擇利用上。本文中菌株UV02_HGΔTup1在YPD培養(yǎng)基中的呼吸強(qiáng)度嚴(yán)重降低，影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，而在高糖環(huán)境下其呼吸強(qiáng)度明顯提高，可能是由于在高滲壓力下的應(yīng)激反應(yīng)中，Tup1基因的缺失誘發(fā)其他調(diào)控因子對(duì)細(xì)胞呼吸進(jìn)行補(bǔ)償。接下來(lái)的工作中可以利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白互作等方法深入研究Tup1基因?qū)︶劸平湍负粑緩降恼{(diào)節(jié)，呼吸強(qiáng)度變化與釀酒酵母耐高糖性狀的具體關(guān)系，以及在Tup1缺失的情況下高滲應(yīng)激反應(yīng)如何補(bǔ)償酵母細(xì)胞呼吸強(qiáng)度。

4 結(jié)論

Tup1基因缺失顯著降低正常生長(zhǎng)條件下釀酒酵母細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度。在高糖環(huán)境下，Tup1基因缺失細(xì)胞呼吸強(qiáng)度有所恢復(fù)，菌株生長(zhǎng)速率和發(fā)酵乙醇產(chǎn)率優(yōu)于出發(fā)菌株，由此可以推斷，Tup1基因參與調(diào)控細(xì)胞呼吸，高糖壓力下Tup1基因缺失可能誘發(fā)其他呼吸補(bǔ)償途徑來(lái)調(diào)控細(xì)胞的高糖應(yīng)激反應(yīng)。