王桂文，黃庶識，陶站華

(廣西科學院，廣西南寧 530007)

0 引言

已有研究顯示，看似均一的微生物群體，其細胞間卻在遺傳、生理、生化或者個體行為上存在很大的差異[1]，這種遺傳上或表觀上的異質性是微生物細胞能夠適應并生存于逆境，或持久生存并給人帶來疾病的基礎[2，3]。該異質性對諸如抗生素或者殺菌劑抗性的研究、工業(yè)發(fā)酵的生產(chǎn)力和穩(wěn)定性、食物防腐的有效性，以及病原微生物的致病潛力等都有非常重要的影響[4-8]。傳統(tǒng)上對微生物的認識多數(shù)是通過研究其群體樣品而得到的統(tǒng)計平均信息，但對微生物的深入研究、認識微生物細胞與環(huán)境的相互作用，僅靠傳統(tǒng)的群體分析難以獲得突破性進展，而技術的進步為探測分析單個細胞甚至單分子提供了可能[9]。單細胞分析技術的發(fā)展在認識細胞的異質性、拓展細胞生物學研究深度等方面發(fā)揮了重要的作用[10]，更有不少報道綜述有關單細胞分析在微生物領域的應用及其分析方法[3，10-14]。基于此，本文簡單回顧基于單細胞的代謝過程分析方法，并重點回顧拉曼鑷子在微生物發(fā)酵領域的一些應用進展，分析其在應用中所存在的問題，認為拉曼鑷子在克服自身不足、融合新的分析技術與數(shù)據(jù)處理方法后，將是了解細胞異質性、認知復雜生物過程的有力手段。

1 基于單細胞的代謝過程分析

單細胞代謝分析可以提供細胞群體內單個細胞代謝異質性的信息。分析過程包含兩方面：單個細胞的分離與單個細胞的分析。目前的分析技術雖然已經(jīng)可以從單個細胞中測量出數(shù)百種代謝物，但樣品的制備仍然是單細胞代謝分析中的一個難題[15]。

細胞的分離(即樣品的制備)是進行單細胞分析的前提，其目的是實現(xiàn)單個細胞的獨立，便于后續(xù)分析。傳統(tǒng)的分離方法是梯度稀釋，新發(fā)展的技術方法主要有：(1)流式技術以及在此基礎上衍生的各種方法，包括流式細胞儀、微流控[16，17]與液滴微流控[18]等；(2)能夠可逆和非動態(tài)地定位單個或多個單細胞的永久固定方法，包括3D微腔，0維、1維和2維禁錮等；(3)單個或多個單細胞被固定并根據(jù)需要釋放的動態(tài)定位方法，通常使用的是外部刺激法，包括機械微操作、光學微操作(光鑷)、散射力(輻射壓力)、光電鑷子、電泳微操作等[11]。

根據(jù)基本屬性，單細胞的分析技術有兩大類：一類是能夠對細胞實行動態(tài)、無損分析的技術，包括無須標記的微光譜化學分析(如拉曼光譜、共振拉曼、表面增強拉曼、相干拉曼和紅外顯微光譜等分子振動光譜方法，以及X射線等)、電化學分析以及熒光介導的微分析(如需要熒光染色的流式細胞儀、熒光顯微鏡、熒光壽命成像、熒光相關光譜等)；另一類是非動態(tài)的、破壞性的分析技術，即質譜和核磁共振等[11]，具體的方法和應用參見Ishii等[12]、Rubakhin等[15]、Fritzsch等[19]、Zenobi[20]和Hodzic[21]的綜述。不斷出現(xiàn)的新技術和新方法，大大地促進了單細胞分析的發(fā)展，提高了人們對生物細胞異質性的認識。然而，很多技術方法的樣品制備過程比較復雜，且需要較長的分析時間，限制了其發(fā)展應用。因此，可以快速提供細胞信息、實時顯示微生物細胞即時生理反應且又簡便靈敏的分析方法，是未來重點發(fā)展的方向。其中，拉曼鑷子技術因具有非接觸、無須標記、無損等優(yōu)點，且具有對單個細胞實施分離和動態(tài)分析的能力，在生物醫(yī)學領域得到了廣泛的應用。

2 拉曼鑷子在微生物發(fā)酵中的應用

拉曼光譜是一種分子振動光譜，其效應來源于光的非彈性散射，直接反映物質分子振動/旋轉振動狀態(tài)[22，23]，在應用于生物材料研究時具有以下獨特優(yōu)勢：一是水分子的拉曼效應很弱，基本上不影響生物細胞的拉曼分析；二是樣品無須特別處理，對樣品沒有破壞性；三是實時、快速；四是樣品需要量極少，可以在單細胞甚至亞細胞水平檢測，因此其在生物醫(yī)學領域有著廣泛的應用[24-28]。在微生物發(fā)酵領域，拉曼光譜主要應用在發(fā)酵進程的總體監(jiān)控方面[29-36]，在單細胞水平開展的研究較少。單個細胞的拉曼光譜包含核酸、蛋白質、多糖和脂類等細胞物質的固有特性信息，是細胞基因型、表型和生理狀態(tài)的表現(xiàn)[37-40]。單細胞拉曼光譜為細胞分析提供了一種便利的、無損的定位手段，可以在亞微米尺度(單細胞水平)探測細胞的生理狀態(tài)[24]，分析化學因子對細胞的影響[41，42]。

拉曼鑷子(Raman tweezers，也稱Laser tweezers Raman Spectroscopy)是激光鑷子與顯微拉曼的結合，融合了無接觸光學操控和拉曼分析的優(yōu)勢，可在接近自然的生理狀態(tài)下研究單個細胞或細胞器，或判別不同類型、不同狀態(tài)的細胞[37,43-45]。與一般的顯微拉曼相比，拉曼鑷子有以下優(yōu)點：(1)光鑷可以將單個活細胞固定在焦點附近進行長時間監(jiān)測(圖1)；(2)細胞處于光束焦點位置，優(yōu)化了散射光的收集光路，獲得更高的信噪比(圖1插圖A)，得到的是被俘獲細胞生化組分光譜信息的疊加；(3)常規(guī)的共焦拉曼光譜采集前需要預處理微生物細胞，費時費力且對細胞的生理狀態(tài)帶來未知的影響，而拉曼鑷子直接將樣品細胞懸浮在無菌水或者生理溶液中，省時省力且能保持細胞正常的生理狀態(tài)。

插圖A為處于光阱或者黏附在蓋玻片的Cupriavidus necator單個細胞的拉曼光譜對比Inset A：Single-cell Raman spectra of Cupriavidus necator cells while trapped or adhered onto cover圖1 拉曼鑷子的基本構成[46，47]Fig.1 Basic composition of Raman tweezers[46,47]

Chan[37]、Redding等[43]和Snook等[48]較為詳細地回顧了拉曼鑷子的應用，但比較寬泛。因此，本部分結合筆者小組在微生物發(fā)酵領域所做的一些探索，重點回顧拉曼鑷子在微生物發(fā)酵領域的一些應用。

2.1 發(fā)酵過程單個細胞的實時監(jiān)測

實時無損無標記生理分析是拉曼鑷子的優(yōu)勢之一，因而其可以長時間對同一個細胞進行實時監(jiān)測，獲知微生物細胞實時的生理變化。拉曼鑷子主要監(jiān)測有特殊產(chǎn)物的細胞或者是有明顯指紋峰的物質，甚至定量分析單個細胞產(chǎn)特定物質的生理過程，比如乙醇發(fā)酵[39]或者物理(化學)脅迫下細胞的動態(tài)生化變化[49]。Peng等[39]通過實時分析單個酵母細胞的發(fā)酵過程，發(fā)現(xiàn)酵母細胞啟動好氧發(fā)酵3 min內就能產(chǎn)生乙醇，而且在高濃度底物下，發(fā)酵起始階段胞內的乙醇濃度高于胞外(胞內外實時乙醇濃度比為1.5左右，圖2)，胞內累積的乙醇隨著胞外底物濃度的降低而釋放。Singh等[49]實時觀察單個酵母細胞在熱處理和高滲透溶液下的應激反應，觀測到遲滯期的酵母細胞轉入含10%葡萄糖的培養(yǎng)液后33 min開始生成甘油和乙醇，在39 min生成速率達到峰值，單個細胞生成約300 amol的甘油和700 amol乙醇。

圖2 10%(W/V)葡萄糖底物發(fā)酵時單個酵母細胞內外乙醇濃度變化的拉曼鑷子監(jiān)測[39]Fig.2 Raman tweezers monitoring of intracellular and extracellular concentrations of ethanol in individual yeast cells during fermentation in YM media after supplementation of 10% (W/V) glucose[39]

當拉曼鑷子系統(tǒng)中使用雙光鑷或者多光鑷俘獲細胞時，可以在相同的生理條件下記錄多個微生物單細胞的實時光譜，了解細胞間的生長動力學和異質性[50]。由于拉曼光譜的信號比較弱，要獲得較強的拉曼信號，需要較強的激光激發(fā)，因此實時分析主要應用在較短時間內的監(jiān)測。

2.2 發(fā)酵過程大量單個細胞的分析

要較好地反映完整的群體發(fā)酵過程，需要分析大量的單個細胞，但是拉曼鑷子難以對多個單細胞實施長時間的實時監(jiān)測。因此，不同的學者應用拉曼鑷子針對不同的發(fā)酵(培養(yǎng))階段隨機選擇一批細胞進行分析，從拉曼光譜的角度展示發(fā)酵過程單個細胞胞內物質的變化動態(tài)，既可以獲知發(fā)酵的總體進程，又可以獲知發(fā)酵過程不同階段或同一階段細胞間的差異，發(fā)現(xiàn)蛋白質二級結構的改變，該技術比常規(guī)的分子生物學手段更加簡便快捷。其中涉及的主要光譜分析手段一是直接讀取蛋白質、脂類、核酸或者目標產(chǎn)物的特征峰信號強度，二是把細胞光譜信息作為一個數(shù)據(jù)整體，結合化學計量學，判別細胞所處的生理狀態(tài)，通過影響因子來分析引起差異的原因。

2.2.1 特殊產(chǎn)物發(fā)酵

微生物細胞通常會在胞內累積聚酯、色素等物質，由于這類物質通常有比較特殊的拉曼特征峰，是拉曼鑷子研究的便利對象。

2.2.1.1 聚酯

聚β-羥基丁酸(PHB)是一種生物塑料[51-53]。已有針對PHB合成的研究主要是基于群體細胞水平在宏觀層面上探索，比如優(yōu)化發(fā)酵環(huán)境[54，55]，應用顯微拉曼進行定量檢測[56]以及分析其含量的異質性[57]。筆者所在的小組[58-61]應用拉曼鑷子分析C.necatorH16菌株PHB累積過程，并跟蹤胞內核酸、蛋白質的代謝動態(tài)。Tao等[59]的實驗結果顯示遲滯期與對數(shù)生長前期是胞內生物大分子代謝的活躍時期，而PHB在發(fā)酵后不久即開始產(chǎn)生，在對數(shù)初期開始大量累積，表明該菌株啟動PHB合成的因素并非營養(yǎng)因子的匱乏(圖3)。

圖3 C.necator H16菌株的生長曲線及胞內RNA (782 cm-1)、DNA (1 574 cm-1)、蛋白質(1 650 cm-1)、PHB (1 732 cm-1)等物質的特征峰強度隨發(fā)酵進程的變化動態(tài)Fig.3 Growth curve of C.necator H16 strain and characteristic peak intensity change of intracellular RNA(782 cm-1 ),DNA(1 574 cm-1),protein (1 650 cm-1),and PHB (1 732 cm-1) with the fermentation process

單個細胞主要生物大分子特征拉曼峰分析顯示，RNA是PHB合成過程代謝中最為活躍的生物大分子。在較高碳濃度下，細胞核酸物質長時間維持在較高的水平；即使僅提供有限的碳源，H16細胞還是將部分碳源用于合成PHB ，而不是將所有的碳源完全用于細胞生長[58]。在不同的氮源下，PHB快速合成期也是胞內生物大分子的活躍期，氮源主要影響RNA和蛋白質的代謝進而影響PHB產(chǎn)物的合成[60]。

不同碳氮比條件下的PHB發(fā)酵分析顯示，在高氮環(huán)境下細胞的RNA含量(782 cm-1峰)和蛋白質含量(1 656 cm-1峰)一直處于較高的水平，兩者呈線性正相關關系。但蛋白質含量(1 656 cm-1峰)與PHB含量(1 732 cm-1峰)呈負相關關系，胞內活躍且含量高的RNA 有可能加強蛋白質的合成，進而削弱PHB 的合成。在高碳氮比環(huán)境下，核酸以及蛋白質的合成受阻，導致碳源的代謝途徑從三羧酸循環(huán)轉向PHB合成路徑[61]。

2.2.1.2 類胡蘿卜素

微生物可以產(chǎn)生各種色素。其中生物來源的類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，比化學合成的類胡蘿卜素具有更低的毒性和更高的生物利用度。類胡蘿卜素是異戊二烯類化合物，具有多個共軛雙鍵結構，在1 157，1 524 cm-1附近各有一個典型的、強烈的特征峰。Tao等[40]采用拉曼鑷子對圓紅冬孢酵母的類胡蘿卜素進行實時定量監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，類胡蘿卜素和脂質的積累主要發(fā)生在指數(shù)期的后期和靜止階段，即當細胞生長受到營養(yǎng)限制時；同時，類胡蘿卜素濃度隨核酸濃度的變化而變化，在培養(yǎng)的第一階段增加，在培養(yǎng)的最后階段減少。袁玉峰等[62]利用拉曼鑷子對紅酵母合成類胡蘿卜素進行分析，考查氮源和碳源對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)適宜紅酵母細胞生長和類胡蘿卜素合成的氮源和碳源分別是酵母粉+胰蛋白胨、葡萄糖。王雪等[63,64]用拉曼鑷子分析紅法夫酵母內蝦青素含量，優(yōu)化了紅法夫酵母生產(chǎn)蝦青素的條件。孫美娟等[65]應用拉曼鑷子對圓紅冬孢酵母合成油脂和類胡蘿卜素進行定量分析，考察不同碳氮比、碳磷比以及碳硫比對圓紅冬孢酵母油脂和類胡蘿卜合成能力的影響，結果表明隨著碳氮比、碳磷比和碳硫比的升高，圓紅冬孢酵母細胞內油脂含量均逐步增加，而類胡蘿卜素的含量均顯著降低。

2.2.1.3 脂肪酸

脂類物質也是學者們研究的重點對象，微藻因能夠合成和儲存可以轉化為生物柴油的脂類(如脂肪酸和三酰甘油TAG)而重新引起學者的重大關注。Wu等[66]應用拉曼鑷子對產(chǎn)油微藻的脂質譜進行直接的、無須標記的在體定量分析，測定微藻內組成脂質的不飽和度和轉變溫度，為微藻的脂質濃度提供相對快速的監(jiān)測。Wang等[67]采用類似的技術在單細胞水平定量表征了微藻產(chǎn)油過程，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)群體層面細胞油脂分析方法難以揭示的規(guī)律，即單個細胞水平的TAG含量與脂類不飽和度呈顯著的負相關關系。單細胞TAG定量技術直接跳過細胞培養(yǎng)環(huán)節(jié)，因此能夠分析未培養(yǎng)的微生物。

2.2.1.4 葡萄球菌黃素

陶站華等[68]分析單個金黃色葡萄球菌細胞內葡萄球菌黃素相對含量，并考察吲哚濃度及培養(yǎng)時間對色素含量的影響。其群體和單細胞水平的光譜數(shù)據(jù)均表明，吲哚可劑量依賴性地抑制葡萄球菌黃素的合成；在分批培養(yǎng)中，群體中大多數(shù)細胞的色素含量在對數(shù)生長中期同步達到最大值，各個時間點的群體內部細胞間色素含量的異質性較小。用1 523 cm-1特征峰強度表征胞內葡萄球菌黃素的相對含量，顯示在22—37℃時，溫度對葡萄球菌黃素合成的影響不大；中性pH最有利于葡萄球菌黃素的合成；在一定濃度范圍內(0.2—5.0 g/L)，葡萄糖可劑量依賴性地促進葡萄球菌黃素的合成，黃酮則可劑量依賴性地抑制葡萄球菌黃素的合成[69]。

上述研究顯示，拉曼鑷子能夠在單細胞水平可靠地分析微生物細胞特殊產(chǎn)物的含量，既可以監(jiān)測有特殊拉曼峰的產(chǎn)物發(fā)酵動態(tài)，又可以同時獲知發(fā)酵過程胞內主要生物大分子的變化動態(tài)。

2.2.2 重組蛋白發(fā)酵

重組蛋白質發(fā)酵是將攜帶重組質粒的工程菌培養(yǎng)至一定密度，經(jīng)誘導后獲得目的蛋白的一種手段。該技術過量表達目的基因，從而獲得大量廉價的目的蛋白，因而單個細胞的拉曼信號可能會有明顯的不同，可通過拉曼光譜方法監(jiān)測其發(fā)酵進程，從而省去蛋白提取、電泳等繁雜的環(huán)節(jié)，為分析細胞的發(fā)酵過程開辟新的可能性。Xie等[70]最先在大腸桿菌和畢赤酵母兩種不同的表達系統(tǒng)中監(jiān)測斑馬魚β生長抑素的表達，發(fā)現(xiàn)單個大腸桿菌或者畢赤酵母相關蛋白峰的信號強度隨著發(fā)酵時間的增加而增強，與凝膠電泳和蛋白印跡分析結果相符。Chan等[71]監(jiān)測髓鞘少突膠質細胞糖蛋白在大腸桿菌中的表達，發(fā)現(xiàn)該蛋白質表達主要發(fā)生在第2小時內，相對于第1小時表達的蛋白質增加470%，而第3小時相對第2小時增加230%，表明3 h內蛋白質的表達開始平穩(wěn)。

盧明倩等[72]研究甲酸脫氫酶(FDH)重組蛋白在大腸桿菌細胞中的表達水平，F(xiàn)DH的特征峰1 004，1 355，1 455和1 667 cm-1隨著IPTG誘導時間的延長而增強，峰信號強度的增加值所反映的FDH表達量增多與SDS-PAGE電泳分析結果一致。

周冰等[73]分析大腸桿菌所表達的蠶豆ViciafabaL. 14-3-3b可溶性蛋白與包涵體蛋白的結構差異，以及不同溫度下兩種蛋白在重組菌中的表達水平，結果表明：16℃下誘導的14-3-3b可溶性蛋白特征峰強度明顯強于28℃下誘導的，而包涵體蛋白的特征峰強度則相反。黃庶識等[74]實時分析不同溫度下上述兩種蛋白的動態(tài)表達水平時發(fā)現(xiàn)：28℃培養(yǎng)條件下，重組菌蛋白質過量表達并以形成包涵體為主；16℃條件下以可溶性蛋白為主，且在該溫度下表達的蛋白質能正確折疊，有利于細胞形成穩(wěn)定的可溶性蛋白。

上述文獻表明，拉曼鑷子對單個活細胞中蛋白質表達等生物過程的實時、無損和定量監(jiān)測具有足夠的敏感性。

2.2.3 生物乙醇發(fā)酵

通過追蹤單個酵母細胞特征拉曼峰信號強度的變化，可有效地分析葡萄糖、乙醇等物質的變化，以及胞內核酸、脂類及蛋白質等生物大分子含量及蛋白質結構的變化。

2.2.3.1 不同發(fā)酵過程下的動態(tài)分析

彭立新等[75]監(jiān)測活性干酵母活化與生長過程：釀酒活性干酵母復水活化后，核酸類物質迅速增加，RNA在第6小時達到最大值；蛋白質和脂類物質從第6小時開始快速增加，在第9小時達到最大值，而后呈下降趨勢；胞內乙醇則是在第9小時開始出現(xiàn)，在第9—12小時期間大量生成。

李自達等[76]分析500 L發(fā)酵罐木薯淀粉濃醪乙醇發(fā)酵過程中酵母細胞內物質的變化，結果顯示酵母細胞為適應濃醪發(fā)酵環(huán)境會調整細胞的生理狀態(tài)和胞內組分：隨著乙醇濃度的升高，酵母細胞累積蛋白質和脂類物質，蛋白質二級結構逐漸以無規(guī)則卷曲為主；在發(fā)酵后期，部分酵母細胞在胞內累積大量的嘌呤類物質。

pH值是影響酵母乙醇發(fā)酵的重要因子。覃趙軍等[77]從拉曼光譜學角度對不同初始pH值的乙醇發(fā)酵過程進行分析，結果顯示發(fā)酵后期，在pH值為3.0的條件下，胞內脂類和蛋白質的拉曼信號最強，表明在低pH值環(huán)境下部分底物被轉化為胞內儲藏物質；主成分分析顯示，pH值對酵母細胞生理狀態(tài)的影響始于發(fā)酵初始階段；1 440和1 600 cm-1峰一直是影響主成分PC1、PC2和PC3分值的主要特征峰，說明pH條件可能影響酵母細胞的脂類物質合成和呼吸代謝，進而影響底物的代謝方向和產(chǎn)物的合成。

覃趙軍等[78]分析不同氮源對酵母乙醇發(fā)酵的影響及其可能的分子機制。在有機氮源下，酵母細胞進入新的發(fā)酵環(huán)境后立即快速合成RNA，并且含量顯著高于無機氮源下的，其RNA拉曼峰的最大平均強度是初始平均強度的1.9—2.1倍(無機氮源的為1.2—1.4倍)；無機氮源下脂類物質和DNA的含量高于有機氮源。有機氮源縮短酵母的遲滯期，促進胞內RNA快速大量合成，促進與氮源代謝、乙醇發(fā)酵相關基因的快速轉錄和表達，進而促進乙醇發(fā)酵。

覃趙軍等[79]分析高滲環(huán)境對酵母乙醇發(fā)酵代謝的影響。高滲透壓會顯著影響782，1 301，1 602，1 657 cm-1峰所表征物質的合成時間和強度，進而影響代謝方向，而耐高滲菌株能適應高滲環(huán)境，調整胞內組分含量，實現(xiàn)高產(chǎn)發(fā)酵。不同滲透壓下影響第一主成分的主要特征峰是1 302—1 306 cm-1和1 443 cm-1等源自脂類物質的拉曼峰，說明滲透壓影響胞內脂類物質的合成。

在逆境發(fā)酵中，不管是普通菌株還是耐乙醇的菌株，RNA物質往往在發(fā)酵前期就開始大量合成，而蛋白質、脂類物質則是在乙醇大量合成的時候才開始大量合成；蛋白質、脂類物質峰的升高與環(huán)境中乙醇濃度有關，與菌株關聯(lián)性不大，可能是酵母菌株應對逆境的手段(結果待發(fā)表)。

2.2.3.2 蛋白質結構的變化

拉曼鑷子除可以監(jiān)測胞內物質的總量變化外，還可以監(jiān)測發(fā)酵過程酵母細胞蛋白質二級結構的變化。

賴鈞灼等[80]在監(jiān)測以葡萄糖為底物的乙醇發(fā)酵動態(tài)過程中發(fā)現(xiàn)：在發(fā)酵前期，細胞1 662 cm-1峰(表征蛋白質酰胺Ⅰ的無規(guī)則卷曲)與1 652 cm-1峰(表征蛋白質酰胺Ⅰ的α螺旋)的強度之比(I1662/I1652)小于1，7 h后大于1，9—18 h基本維持在同一水平，而后呈現(xiàn)上升趨勢，說明發(fā)酵初期胞內蛋白的二級結構以有序的α螺旋為主，隨著發(fā)酵的進行，酵母細胞蛋白質以無規(guī)則卷曲為主。在李自達等[76]研究的高濃度底物酵母發(fā)酵后期，也出現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。而在以酵母粉為氮源的不同發(fā)酵階段，部分細胞的蛋白質酰胺Ⅰ的二級結構以β折疊為主，也有部分細胞以α螺旋為主，還有一部分細胞則是兩者基本均衡，而以其他物質為氮源的細胞則是以α螺旋占絕對主導地位[78]。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因有可能是在較高濃度的乙醇環(huán)境下，酵母細胞為適應胞內外乙醇環(huán)境的變化而改變蛋白質的二級結構。

2.2.4 發(fā)酵過程中細胞的異質性

針對大量單個細胞的分析可以獲知群體細胞的生理狀態(tài)以及細胞間的差異。

在濃醪乙醇發(fā)酵中，胞內蛋白質和脂類物質(特征峰1 301，1 440，1 654 cm-1)在發(fā)酵前、中期的細胞間差異較小，而發(fā)酵后期(32，44 h)這兩類物質的含量顯著增加，胞間差異明顯增大；核酸類物質，在發(fā)酵前、中期，782 cm-1與1 094 cm-1的信號峰強度呈離散分布，但進入發(fā)酵后期后，核酸含量增加且在細胞間的分布接近正態(tài)分布；嘌呤物質(特征峰1 480 cm-1)在發(fā)酵的前、中期胞內含量很少，胞間差異不大，而在發(fā)酵的后期迅速增加，細胞間差異大且呈兩極分化，含量較少的細胞占多數(shù)，含量很高的細胞占少數(shù)[76]。

在PHB發(fā)酵中，直方統(tǒng)計分析顯示，發(fā)酵前期細胞間胞內PHB含量差異較大，發(fā)酵中期相對均勻、胞間差異小，但發(fā)酵后期胞間差異顯著[59]。根據(jù)奇異值分布可知菌體的代謝方向、產(chǎn)物的差別自發(fā)酵開始就不一致，并且隨著發(fā)酵的進行差異越來越大[60]。

3 存在的問題

3.1 熒光背景

熒光對拉曼監(jiān)測有非常嚴重的干擾[81]，拉曼鑷子也存在同樣的問題，特別是在溶液或者細胞有自發(fā)熒光的時候，拉曼信號通常湮滅于熒光中。Cormack等[82]發(fā)現(xiàn)使用拉蓋爾-高斯(LG)和Holey高斯激光時，可以減少拉曼系統(tǒng)中光學元件的背景熒光。另外，也可以使用長波長的激光(比如1 064 nm)來激發(fā)拉曼信號[83]，或者通過數(shù)據(jù)處理來消除熒光的影響[84]。其他熒光背景消除方法還有表面增強拉曼光譜技術、傅立葉變換拉曼光譜技術，或者加入熒光淬滅劑，但是后者可能會影響細胞的活性。

3.2 激光損傷

激光長時間俘獲同一個細胞可能會對細胞產(chǎn)生傷害，特別是在激光功率比較大的時候。激光光損傷主要包括光化學損傷(例如氧化、DNA損傷、細胞代謝)和光熱(熱致)損傷，損傷的程度與使用的波長、細胞類型有關。由于拉曼鑷子的細胞處于溶液中，因此減小了光熱損傷，對細胞的損失主要是光化學損傷。Singh等[49]使用能量較低的長波長近紅外激光(1 064 nm)用于俘獲細胞，而用短波長的激光(532 nm或者785 nm)激發(fā)細胞的拉曼信號；或者是用同一束激光俘獲與激發(fā)細胞，在激發(fā)拉曼的時候用較高功率而在俘獲的時候用較低功率，以減少激光對被俘細胞的傷害。

3.3 分析效率

單個光鑷的分析效率比較低，特別是長時間監(jiān)測細胞的實時動態(tài)時。為提高分析效率，陸續(xù)發(fā)展了雙光鑷[50]或者多光鑷的實驗系統(tǒng)[85，86]，可以在相同的條件下同步監(jiān)測多個細胞。對于大量單個細胞的非實時在線分析，黃超等[87]、毛麗華等[88]將拉曼鑷子與微流控結合；Casabella等[89]發(fā)展了自動分析單個細胞的拉曼鑷子系統(tǒng)，實現(xiàn)單個細胞光譜信息的自動采集；而Pilát等[90]將拉曼鑷子與微流控系統(tǒng)結合，發(fā)展了自動分析和在無菌條件下分選微生物細胞的方法。除對實驗系統(tǒng)的提升之外，Zhang等[91]在多光鑷拉曼鑷子的基礎上發(fā)展了一種基于壓縮傳感的單次采集多焦拉曼光譜技術，將常規(guī)拉曼光譜的速度提高2—3個數(shù)量級，并有望應用于監(jiān)測大尺寸生物系統(tǒng)的快速動力學研究。同時，Zhang等[92]還發(fā)展了一種壓縮感知框架下的分層稀疏方法，結合組內稀疏性和組內選擇策略進行光譜重建，有望在長時間同步監(jiān)測多個細胞的生物過程中得到廣泛應用。

3.4 信號增強

相對而言，拉曼鑷子在一定程度上提高了信噪比，獲得了更好的信號，但信號弱依然是其需要克服的弱點。為解決該問題，表面增強拉曼散射(SERS)、共振拉曼光譜(RRS)、相干反斯托克斯拉曼光譜(CARS)以及受激拉曼光譜(SRS)相繼發(fā)展，將拉曼信號增強幾個數(shù)量級。Huai等[93]將光鑷與SERS結合應用于蛤蚌毒素的快速檢測， Ramser等[94-96]將光鑷與共振拉曼結合應用于功能血紅細胞和血紅蛋白的分析，以及細菌表達神經(jīng)珠蛋白，但這些技術方法很少應用到發(fā)酵分析領域。

3.5 數(shù)據(jù)處理與挖掘

拉曼鑷子得到包含核酸、蛋白質、多糖和脂類物質等反映細胞固有特性的信息，是所有光譜信息的疊加，如何把關鍵的信息提取出來是拉曼光譜分析的難點[97]。由于同一個拉曼譜帶有可能來源于幾個不同的分子或基團，單變量分析嚴重限制了詳細信息的獲得。如果把整個拉曼信息看成數(shù)學數(shù)據(jù)，則可以應用常規(guī)的化學計量學方法來提取光譜特征信息，從而判別細胞的生理狀態(tài)。常用的方法有主成分分析(PCA)和奇異值分解，兩者都是一種簡化數(shù)據(jù)集的技術。通過PCA并分析主要PC的載荷與相關特征峰的相關性，從中可以獲知不同發(fā)酵階段微生物細胞胞內主要生物大分子的合成特點[58-61,76，77,79]。Iwasaki等[98]通過拉曼顯微鏡可視化分子特異性信息，用多元曲線分辨率分析從拉曼光譜中提取隱藏的關鍵信息，首次在微藻Euglenagracilis蠟酯發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)兩種不同形式的肉豆蔻酸酯的積累。此外，中科院青島過程與能源所提出“拉曼組”(Ramanome)概念(指特定狀態(tài)下一個細胞群體的單細胞拉曼光譜集合)，并以萊茵衣藻、微擬球藻等為模式，基于拉曼組技術，建立可同時定量單個細胞中淀粉、蛋白質、甘油三酯含量和脂質不飽和度的方法[99-101]。

3.6 與其他技術的結合

從前面的論述可以看出，拉曼鑷子最適宜用于實時監(jiān)測的是目標明確的特征拉曼峰，但一般的細胞光譜是整個細胞物質的疊加，影響了拉曼鑷子實時監(jiān)測的應用。Wang等[102]，Xu等[103]將拉曼光譜與穩(wěn)定同位素標記(SIP)結合(同位素的摻入改變了所摻入分子鍵的拉曼帶)，通過氘化代謝底物推導物質循環(huán)過程，獲知物質代謝動態(tài)。Lu等[104]將拉曼鑷子與人工智能技術結合，實現(xiàn)微生物單細胞水平的快速準確鑒定。

拉曼鑷子得到的主要信息是底物、產(chǎn)物和核酸、蛋白質、脂類等生物大分子的信息，如果與單細胞測序、基因表達分析或者組學分析相結合，廣泛涵蓋單個細胞中的大多數(shù)成分，則可深入了解細胞異質性的機制。

此外，目前的研究還沒有完全闡明細胞異質性對生物性能的影響，但所有研究的最終目標是將其應用到實際生產(chǎn)中，提高發(fā)酵性能。對拉曼鑷子來說，在相對短的時間內獲取大量單個細胞的信息用于系統(tǒng)生物學的建模[105]，還需要提高系統(tǒng)的靈敏度和檢測數(shù)量。

4 展望

微生物發(fā)酵是個復雜的過程，是大量單個細胞綜合表現(xiàn)的結果，但細胞間存在明顯的異質性，通過單細胞分析了解微生物細胞的異質性，有利于發(fā)酵環(huán)境的優(yōu)化，從而減少細胞間的異質性，提高發(fā)酵性能。拉曼鑷子融合了拉曼光譜和光學操控的優(yōu)點，無破壞、無須標記，可以監(jiān)測單個細胞的實時生理狀態(tài)，表征微生物細胞的生理功能，還可以作為一種工具來分析大群體中相對較小的單細胞群體(數(shù)千個細胞)，以獲得樣本異質性的統(tǒng)計信息，并在單細胞水平上研究細胞動力學。本文重點回顧了拉曼鑷子在監(jiān)測乙醇發(fā)酵、細胞色素、聚酯及脂肪酸發(fā)酵以及重組蛋白表達等領域的應用進展，顯示拉曼鑷子實時監(jiān)測發(fā)酵過程中物質變化的能力以及從單個細胞水平上研究發(fā)酵過程的潛能。由于細胞代謝快速、胞內成分多樣，以及拉曼技術還存在信號較弱、分析效率不高以及光損傷等問題，拉曼技術不能完全、迅速和無損地監(jiān)測發(fā)酵過程多個單細胞的代謝物。即便如此，已有的研究仍從分子光譜和單細胞角度為微生物發(fā)酵提供了新的認識。因此，如能克服自身不足，融合新的分析技術和數(shù)據(jù)處理手段，拉曼鑷子將在微生物單細胞分析領域發(fā)揮更大作用。將拉曼分析、微流控分選與組學分析結合起來，則可同時獲知更全面的信息，無疑將推進生物單細胞分析及對其異質性的認識，提高對復雜生物系統(tǒng)的認知。