任美佳，張華平，鐘聰慧，張世卿，黃家風*

(1 石河子大學農學院/新疆綠洲農業(yè)病蟲害治理與植保資源利用重點實驗室，新疆 石河子 832003;2 新疆生產建設兵團第一師農業(yè)技術推廣站，新疆 阿拉爾 843300)

庫爾勒香梨栽培歷史悠久、香甜可口、脆爽多汁，具有很高的商品價值與很大的市場競爭優(yōu)勢，在新疆水果產業(yè)中占據(jù)重要地位。但近幾年黑斑病的發(fā)生使庫爾勒香梨生產遭受嚴重危害，尤其是2018年梨黑斑病導致阿拉爾市庫爾勒香梨大面積掉果、爛果，導致近20 hm2果園幾乎絕收，對果農造成了嚴重的經濟損失。

研究表明，梨黑斑病主要由鏈格孢屬(Alternaria)真菌引起，目前，全世界從梨上分離并命名的鏈格孢有9個種[1-3]，中國在梨上發(fā)現(xiàn)的鏈格孢有6個種，分別為交鏈格孢(A.alternata)、細極鏈格孢(A.tenuissima)、梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)、侵染鏈格孢(A.infectoria)[3-4]、鴨梨侵染鏈格孢(A.yaliinficiens)和A.ventricosa[1-2]。鏈格孢屬真菌種類繁多，兼具寄生性與腐生性，在作物生長期或貯藏期均能侵染植物造成危害，如A.mali在蘋果上[5]、A.brassicae在生菜和胡蘿卜上[6-7]、A.viniferae在葡萄上[8]、A.cucumerina在南瓜、甜瓜、西葫蘆等瓜類作物上[9]引起黑斑病或葉枯病，導致品質下降、產量降低，因此鏈格孢屬真菌是引起植物病害的重要類群之一。

鏈格孢屬真菌分類是一個很有爭議的問題，形態(tài)特征一直是鏈格孢屬分類的主要依據(jù)，如梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)相對于交鏈格孢(A.alternata)，孢子更大，孢子鏈更短、幾乎沒有分支，因此可以依據(jù)孢子大小與產孢方式將其進行有效區(qū)分[10]。然而對于大多數(shù)小孢子種，因物種之間的高度相似性以及存在一些具有中間性狀的菌株，僅憑形態(tài)學特征很難進行種類鑒定[11]。因此，越來越多的種類鑒定增加了基因進化關系作為分類依據(jù)，如基于β-微管蛋白基因(tub)、過敏原基因(Alt-a1)、組蛋白基因(His)、翻譯延長因子基因(tef1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gpd)、內切半乳糖醛酸酶基因(endoPG)構建單基因系統(tǒng)發(fā)育樹，通過系統(tǒng)進化關系對鏈格孢進行種類鑒定，有力促進了鏈格孢分類[11-15]。但是該方法依然存在局限，因為分別以不同的單基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹對同一個菌株進行種類鑒定時，得到的結果往往不一致[16]。近年發(fā)展的多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析法，在一定程度上克服了單基因存在的橫向基因轉移和不同基因間進化速率差異對系統(tǒng)發(fā)育樹的影響，得到的結果比單基因系統(tǒng)發(fā)育分析更為準確，在原核和真核生物的系統(tǒng)發(fā)育研究中得到了廣泛應用[17]。如Somma等基于翻譯延長因子基因(tef)、β-微管蛋白基因(tub)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gpd)和過敏原基因(Alt-a1)構建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對引起小麥黑斑病的164個鏈格孢菌菌株進行了鑒定，明確了菌株的種類及其進化關系[16]。

本研究為了明確新疆阿拉爾市庫爾勒香梨發(fā)生的黑斑病病原，對病株中分離到的鏈格孢菌進行了致病性測定，在形態(tài)學基礎上結合多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，基于過敏原alt-a1基因(Alt-a1)、鈣調蛋白基因(Cal)和翻譯延長因子基因(tef1)構建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對病原菌進行了種類鑒定，為科學防治梨黑斑病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年9月于新疆生產建設兵團第一師八團梨園隨機采集表現(xiàn)明顯黑斑的庫爾勒香梨病果41個，4 ℃冰箱保存用于病原菌分離。致病性鑒定所需梨果為同一地區(qū)采集和市售的健康庫爾勒香梨。

1.2 梨黑斑病病原菌的分離與純化

對具有典型黑斑癥狀的果實，采用常規(guī)組織分離法在病健交界處切取0.5 cm×0.5 cm組織塊，依次用0.1%的升汞消毒20 s，75%乙醇消毒10 s，滅菌水清洗3次。然后將組織塊用滅菌濾紙吸干置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d；對分離得到的真菌再通過單孢分離獲得純培養(yǎng)菌株。將分離純化的菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，根據(jù)菌落形態(tài)和分生孢子的形態(tài)將初步確定為鏈格孢的菌株用20%甘油保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株的致病力測定

將分離純化的鏈格孢菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用滅菌打孔器打取直徑為1 cm菌餅；再用75%乙醇對庫爾勒香梨健康果實進行表面消毒；然后分別通過無傷和有傷接種對分離純化的菌株進行致病性鑒定。無傷接種是將菌塊直接貼于健康梨果表面，用封口膜固定，于25 ℃保濕培養(yǎng)[18]。有傷接種是先用滅菌針在健康果面刺約3 mm深的小孔，再將菌塊貼于健康梨果表面，用封口膜固定，于25 ℃保濕培養(yǎng)。每24 h觀察接種發(fā)病情況，待發(fā)病揭去菌餅。每個菌株設3個重復，以未接菌的PDA貼塊作為空白對照。

1.4 梨黑斑病病原菌的形態(tài)學鑒定

將有致病力的鏈格孢菌株根據(jù)其在PDA上的培養(yǎng)特征各選取1個代表菌株(P8和P21菌株)進行形態(tài)學鑒定。將菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，用滅菌刀片在菌落邊緣切取大小為3 mm×3 mm×2 mm的菌塊，置于滅菌載玻片中央，用蓋玻片壓住菌塊邊緣，在25 ℃明暗交替條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d，在光學顯微鏡下觀察蓋玻片下病原菌的產孢方式；對PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌株，用滅菌牙簽挑取平板上的孢子，在光學顯微鏡下觀察病原菌分生孢子的形態(tài)、顏色及隔膜數(shù)，至少測量100個分生孢子大小并進行統(tǒng)計。根據(jù)相關文獻[19]進行病原菌形態(tài)學鑒定。

1.5 梨黑斑病病原菌的分子鑒定

將代表菌株P8和P21分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，用滅菌載玻片輕輕刮取培養(yǎng)基表面的真菌菌絲和分生孢子，利用真菌DNA提取試劑盒(BioFlux)提取代表菌株的DNA。分別用過敏原基因(Alt-a1)的引物AltaF(5′-ATGCAGTTCACCACCATCGC-3′)和AltaR(5′-ACGAGGGTGAYGTAGGCGTC-3′)[13]、鈣調蛋白基因(Cal)的引物CalF(5′-AGCAAGTCATCTCCGAGTTCAAGG-3′)和CalR(5′-CTTCTGCATCAYCTGGACG-3′)[20]、翻譯延長因子基因(tef1)的引物EF-1(5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′)和EF-1R(5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′)[21]從各菌株基因組DNA中擴增相應的基因片段并測序。將測序結果在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上通過BLAST比對；在GenBank中下載相關參考序列，分別按照Alt-a1和tef1的順序、Alt-a1和Cal的順序進行基因序列整合；以匍柄霉(StemphyliumVesicarium)相應的基因序列為外緣[16]，在MEGA 7.0.20軟件中按照BIC標準選擇最佳模型，通過最大似然法Maximum Likelihood(ML)構建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹，對鏈格孢代表菌株進行進化分析。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離與致病性測定

對庫爾勒香梨上表現(xiàn)明顯黑斑的病組織進行真菌分離，共獲得36個純培養(yǎng)菌株，根據(jù)菌落特征和分生孢子形態(tài)，其中34個菌株可初步確定為鏈格孢屬(Alternaria)真菌，占分離菌株總數(shù)的94.4%。如圖1所示，以P8為代表的菌株在PDA上形成的菌落外圈具白色邊緣、中間棕綠色、最內圈深褐色，有角狀花紋，占鏈格孢菌株的23%；以P21為代表的菌株菌落最外圈白色邊緣、中間棕綠色、深褐色內圈與P8菌株相比明顯變小，無明顯角狀花紋，占鏈格孢菌株的61.5%。對34個鏈格孢菌株進行無傷和有傷接種，結果均能在健康果面造成與田間相似的癥狀(圖1)：田間自然發(fā)病的病斑初期為黑褐色圓形小點，隨梨果生長病斑逐漸變大，且稍有凹陷，部分病斑為同心輪紋斑。對健康梨果進行有傷接種，3 d即可在接種部位觀察到黑褐色壞死斑點，隨著接種時間的延長，病斑逐漸變大并略有凹陷；無傷接種5～7 d時才能在接種部位產生黑褐色壞死斑點，病斑形狀與有傷接種相似。上述結果表明，從庫爾勒香梨上分離獲得的鏈格孢是導致黑斑病的致病菌。

圖1 庫爾勒香梨黑斑病的癥狀及病原菌培養(yǎng)性狀

2.2 病原菌的形態(tài)學鑒定

從上述致病的鏈格孢中選取P8和P21菌株作為代表菌株進行形態(tài)學鑒定。如圖2所示，P8菌株的分生孢子梗為褐色，具分枝。分生孢子短鏈生，孢子鏈一般由10個以內孢子構成；孢子鏈的中間孢子與頂端孢子基部以合軸式延伸產孢，形成樹狀短分支的分生孢子鏈。分生孢子為倒棍棒形、卵形或長橢圓形；淡褐色至褐色，表面光滑或具微刺；具2～5個橫膈膜，0～3個縱隔膜；大小為(6.0～12.5) μm×(11.2～34.5) μm，平均大小為9.3 μm×20.3 μm；無喙或具短喙，部分喙可轉變?yōu)楫a孢假喙，喙及假喙長0～17.7 μm。根據(jù)這些形態(tài)學特征，初步將P8菌株的種類鑒定為交鏈孢(Alternariaalternata)。

A至C為產孢梗及產孢方式；D至F為分生孢子。

如圖3所示，P21菌株的分生孢子梗淡褐色，偶分枝。分生孢子鏈生，一般由10個以上孢子構成；因多數(shù)孢子只在假喙頂端次生產孢，所以分生孢子長鏈多不分枝。分生孢子倒棍棒形或倒梨形，淡褐色至中褐色，表面光滑或具微刺；成熟分生孢子具4～7個橫隔膜，0 ～2個縱隔膜，孢子中部有2～3個主橫隔膜，明顯較粗，略隘縮；大小為(8.6～16.2)μm×(15.9～41.2)μm，平均值為 12.7 μm×25.9 μm，喙及假喙柱狀，長0～44.1 μm。根據(jù)這些形態(tài)學特征，初步將P21菌株的種類鑒定為細極鏈格孢(Alternariatenuissima)。

A至B為分生孢子鏈；C為產孢梗；D至F為分生孢子。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定

對P8菌株和P21菌株的基因組DNA進行過敏原基因(Alt-a1)、翻譯延長因子基因(tef1)、鈣調蛋白基因(Cal)的PCR擴增，P8菌株獲得3個基因長度分別為472、240、787 bp，P21菌株獲得3個基因長度分別為472、240、786 bp。將所有測序結果在NCBI進行比對，結果顯示，2個菌株的Alt-a1基因均與交鏈孢(A.alternata)和A.citri具有最高序列相似性(100%)；P8菌株的tef1基因與交鏈孢具有最高序列相似性(98.3%)，P21菌株的tef1基因與交鏈孢、細極鏈格孢(A.tenuissima)和A.citri均具有100%序列相似性；P8和P21菌株的Cal基因均與A.malvae具有最高的序列相似性，分別為100%和99.6%。因此從單個基因的測序結果無法對2個菌株的種類進行確定。

基于Alt-a1和tef1基因序列構建多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，P8菌株單獨與交鏈孢的2個菌株(LH-4菌株和HMCH-9菌株)聚類在一個小的進化分支上；基于Alt-a1和Cal基因序列構建基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，P21菌株與細極鏈格孢的3個菌株(EGS38.029、EGS34.015和X1147菌株)聚類在一個進化分支上。因此系統(tǒng)發(fā)育分析進一步支持了上述形態(tài)學鑒定結果，明確P8菌株的種類是交鏈孢(A.alternata)，P21菌株的種類是細極鏈格孢(A.tenuissima)。

圖4 基于過敏原基因和翻譯延長因子基因構建的P8菌株與其他鏈格孢菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于過敏原基因和鈣調蛋白基因構建的P21菌株與其他鏈格孢菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

(1)本研究結果表明，庫爾勒香梨黑斑病的主要病原種類是交鏈孢(A.alternata)和細極鏈格孢(A.tenuissima)，分離比例分別為23.0%和61.5%。這與我國其他地區(qū)報道的梨黑斑病病原種類的研究結果基本一致，嚴進等[4]從河北和山東鴨梨黑斑病上分離鑒定的病原種類是交鏈孢、細極鏈格孢和侵染鏈格孢(A.infectoria)，其比例分別是41%、54.8%和1.6%；朱紅艷[3]從湖北地區(qū)的梨黑斑病上分離鑒定的主要病原種類是交鏈孢和細極鏈格孢，梨黑斑鏈格孢(A.gaisen)所占比例較少(4.9%)。鏈格孢屬真菌大多數(shù)種類兼性寄生于植物上，引起包括禾谷類作物、油料作物、果蔬作物及觀賞植物在內的多種經濟植物病害，造成田間和產后損失，是經濟上非常重要的病原真菌[22]，其中交鏈孢和細極鏈格孢寄主范圍廣泛，除引起梨樹黑斑病外，在我國還侵染危害蘋果、棗、藍莓、菠蘿、枸杞等果樹[23-27]，因此交鏈孢和細極鏈格孢是引起我國果樹黑斑病的主要病原種類。

(2)盡管形態(tài)學特征在鏈格孢屬真菌一些種的鑒定上存在難以界定的困難，但依然是種類鑒定不可替代的重要依據(jù)。本研究依據(jù)產孢方式和分生孢子形態(tài)將引起庫爾勒香梨黑斑病的鏈格孢鑒定為交鏈孢和細極鏈格孢。在產孢方式上，交鏈孢以合軸式方式產孢，形成樹狀短分支的分生孢子鏈，孢子鏈一般由10個以內的孢子構成；細極鏈格孢的孢子鏈多為不分支的長鏈，一般由10個以上孢子構成。分生孢子形態(tài)差異表現(xiàn)在細極鏈格孢的成熟孢子中部有2～3個主橫隔膜，明顯較粗；且細極鏈格孢的分生孢子略大于交鏈格孢的分生孢子。因此形態(tài)學特征對交鏈孢和細極鏈格孢的種類鑒定非常重要。

(3)基于不同的單基因對同一個鏈格孢菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析時，由于所獲結果往往不一致，因此越來越多的鏈格孢種類鑒定采用了多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，如基于ITS，Alt-a1和gpd序列構建系統(tǒng)進化樹，王彩霞[8]將引起葡萄葉斑病的鏈格孢鑒定為3個種；基于ITS、gapdh、rpb2、tef1、Alt-a1和endoPG序列，日本學者[10]將造成草莓黑斑病的鏈格孢鑒定為梨黑斑鏈格孢(A．gaisen)。本研究分別基于Alt-a1和Cal基因、Alt-a1和tef1基因構建系統(tǒng)進化樹，將庫爾勒香梨鏈格孢P8和P21菌株分別鑒定為交鏈孢和細極鏈格孢，并與形態(tài)學鑒定結果一致。利用基因序列對鏈格孢進行系統(tǒng)進化分析時發(fā)現(xiàn)，在NCBI上檢索單個基因時可以獲得很多相關參考基因，但對多個目標基因進行檢索時，因不同的菌株可利用的參考基因不同，導致基于3～4個基因構建系統(tǒng)進化樹時可利用的參考菌株很少，如本研究采用Alt-a1、Cal和tef13個基因構建系統(tǒng)進化樹時，因具有相同目標基因的參考菌株很少，只能針對P8菌株基于Alt-a1和tef1基因搜索具有相應基因的參考菌株、針對P21菌株基于Alt-a1和Cal基因搜索具有相應基因的參考菌株，構建了2個系統(tǒng)進化樹對2個菌株分別進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，因此目前利用多基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析還存在局限，隨著今后有關鏈格孢的深度測序將有助該方法的廣泛應用。