劉小飛，于 波，黃麗麗，孫映波

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】杜鵑紅山茶（Camellia azalea）為山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）常綠灌木或小喬木，自然分布于廣東省陽(yáng)春市鵝凰嶂自然保護(hù)區(qū)，為廣東省重點(diǎn)保護(hù)野生植物。杜鵑紅山茶花期長(zhǎng)，在適宜條件下可四季開(kāi)花［1］，為山茶屬植物的園林應(yīng)用打開(kāi)了廣闊前景。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于杜鵑紅山茶的研究主要集中在瀕危原因及保護(hù)、生物學(xué)特性及新品種選育等方面［2］，而分子生物學(xué)水平上的相關(guān)研究較少，僅有少量關(guān)于其葉綠體基因組方面的研究［3］，基因功能方面的相關(guān)研究少見(jiàn)，而篩選杜鵑紅山茶適用的qRT-PCR內(nèi)參基因可為杜鵑紅山茶基因功能研究提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。【前人研究進(jìn)展】在基因功能挖掘的過(guò)程中，基因表達(dá)模式是分析基因在物種中所起作用的重要方法之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是目前基因表達(dá)分析的主要方法之一，要確保其結(jié)果的可靠性與準(zhǔn)確性，需要選擇研究條件下適用的內(nèi)參基因或組合基因來(lái)檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以提高結(jié)果的可靠性。轉(zhuǎn)錄延伸因子的編碼基因（EF1α）［4-5］、α-tubulin（TUA）［6］、β-tubulin（TUB）［4］、Ubiquitin（UBQ）［7］、肌動(dòng)蛋白（Actin）［8-10］和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）［8］等看家基因常被用作各物種篩選內(nèi)參基因的候選基因。研究發(fā)現(xiàn)，在不同條件下，內(nèi)參基因的表達(dá)量也會(huì)發(fā)生變化，例如火龍果在不同的脅迫條件下與不同組織中的適用內(nèi)參基因不同［5］，擬南芥在二倍體和四倍體中所用的內(nèi)參基因數(shù)目有差異［11］，類似的情況也存在于檸條錦雞兒［12］和白樺［13］中。因此，正確選擇、使用內(nèi)參基因?qū)蚬δ艿难芯匡@得尤為重要。這方面的研究在杜鵑紅山茶中尚未見(jiàn)報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】選擇EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH等6個(gè)看家基因作為候選內(nèi)參基因，通過(guò)不同的計(jì)算程序GeNorm和NormFinder評(píng)估這些看家基因在杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中的穩(wěn)定性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】篩選出適用于杜鵑紅山茶不同組織和不同時(shí)期花瓣qRT-PCR分析的內(nèi)參基因。利用篩選出的適用于不同條件下的內(nèi)參基因，分析目的基因CaGASA3的表達(dá)模式，驗(yàn)證在杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中最佳內(nèi)參基因的可靠性，以期為進(jìn)一步研究杜鵑紅山茶的關(guān)鍵功能基因提供技術(shù)保障和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試樣品來(lái)源于生長(zhǎng)健壯的杜鵑紅山茶樹（栽種于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所茶花資源圃內(nèi)，N23°23'、E113°23'），樹齡5年，樹高3 m，冠幅1 m，直徑3.5 cm。取幼根（YR）、成熟根（MR）、幼葉（YL）、成熟葉（ML）、4期花瓣（PS4）和5期花瓣（PS5）用于篩選不同器官適用的qRT-PCR分析的內(nèi)參基因，3次重復(fù)；選取花蕾長(zhǎng)度分別為0.5 cm（S1）、1.0 cm（S2）、1.5 cm（S3）以及4期花瓣（S4）和5期花瓣（S5）用于篩選花發(fā)育不同時(shí)期適用的qRT-PCR分析的內(nèi)參基因，3次重復(fù)。用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑儀器設(shè)備：UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（B511321，生工生物工程股份有限公司），熒光定量PCR儀（StepOne Puls型，美國(guó)ABI公司），凝膠成像儀（FR-980A，上海復(fù)日科技有限公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（TD5AWS，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司），電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠），電泳槽（DYCP-32B，北京六一儀器廠），微型旋渦混合儀（WH-3，上海滬西分析儀器廠有限公司），數(shù)顯恒溫水浴鍋（HS-800D，太倉(cāng)市科教器材廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 總RNA提取采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒（B511321），具體操作參照說(shuō)明書。400 ng RNA用于cDNA第一鏈合成，方法參照文獻(xiàn)［9, 14］稍作改動(dòng)。所得cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 內(nèi)參基因的選擇和引物設(shè)計(jì) 參考已有的研究報(bào)道［4-10］，在杜鵑紅山茶轉(zhuǎn)錄組結(jié)果（中國(guó)國(guó)家生物信息中心登錄號(hào)：CRX165336）中篩選出6個(gè)差異不顯著的看家基因作為候選內(nèi)參基因，分別為EF1α、TUA、TUB、UBQ、Actin和GAPDH。引物通過(guò)NCBI-blast設(shè)計(jì)，所用參數(shù)為：擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為100～250 bp，引物長(zhǎng)度為18～25個(gè)堿基，GC含量45%～55%，Tm值為60（± 3）℃。各內(nèi)參基因的引物信息見(jiàn)表1，由生工生物工程股份有限公司合成引物。

1.2.3 qRT-PCR反應(yīng)條件 利用LightCycler480II型熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，采用20 μL反應(yīng)體系，其中2X SG Fast qPCR Master Mix（B639271, BBI, Roche）10 μL、ddH2O 7.2 μL、10 ng/μL cDNA 2 μL、上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）分別為0.4 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，45 個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)3次重復(fù)。

表1 6個(gè)候選內(nèi)參基因的引物信息Table 1 Primer information of 6 candidate reference genes

1.2.4 引物特異性鑒定及擴(kuò)增效率計(jì)算 通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳的方法對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行分析，分析反應(yīng)熔解曲線圖，判斷所設(shè)計(jì)引物的特異性。將所有cDNA原液等量混合后稀釋，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，分別為cDNA原液的100、10-1、10-2、10-3、10-4倍，測(cè)定qRT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。程序運(yùn)行完成后計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)（R2）和擴(kuò)增效率（E）。

1.2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗(yàn)證及CaGASA3基因表達(dá)模式分析 以綜合排名穩(wěn)定的2個(gè)內(nèi)參基因來(lái)校準(zhǔn)杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中CaGASA3的表達(dá)量，驗(yàn)證所篩選的內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。CaGASA3基因qRT-PCR擴(kuò)增所用的引物為：上游引物5'CTTTCACCACCTGGGTTTGG3'，下游引物5'CTCACTGAAGGCCGTGGTAAA3'。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析與內(nèi)參基因的確認(rèn) 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和OriginPro 9.1進(jìn)行整理，利用GeNorm［15］和NormFinder［16］評(píng)估6個(gè)候選內(nèi)參基因在杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中的表達(dá)穩(wěn)定性，依據(jù)評(píng)估結(jié)果對(duì)各候選基因進(jìn)行排序，篩選出兩組樣品中適用的內(nèi)參基因。最適內(nèi)參基因數(shù)目的確定可以利用GeNorm計(jì)算配對(duì)變異值（Pairwise Variation Value）來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)Vn/n+1＞0.15時(shí)，應(yīng)當(dāng)選擇n+1個(gè)內(nèi)參基因作進(jìn)一步校正，若Vn/n+1＜0.15，則無(wú)需引入n+1個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行校正，n個(gè)內(nèi)參基因已達(dá)到準(zhǔn)確校正目的基因表達(dá)量的要求。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量及引物特異性

以杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣為材料提取總RNA，經(jīng)過(guò)平板電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，28S和18S條帶清晰（圖1），OD260/280介于1.86～2.03之間，表明獲得的總RNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

圖1 杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時(shí)期花瓣（B）總RNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different organs（A）and petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.2 引物擴(kuò)增特異性分析和擴(kuò)增效率

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)平板電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖2）顯示，產(chǎn)物大小介于132～227 bp之間，符合設(shè)計(jì)預(yù)期，產(chǎn)物單一且無(wú)雜帶，表明所設(shè)計(jì)引物的特異性較好；同時(shí)，利用所選的6個(gè)候選內(nèi)參基因引物，分別對(duì)杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣的5個(gè)濃度梯度（10倍稀釋）的cDNA模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因的相關(guān)系數(shù)R2＞0.9927（表2），表明cDNA模板量與對(duì)應(yīng)的Ct值有較好的線性關(guān)系，滿足qRT-PCR要求。同時(shí)，6個(gè)候選內(nèi)參基因在兩組樣品中的熔解曲線均為單峰（圖3），且重復(fù)性好，可用于不同器官和不同時(shí)期花瓣中的后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 6個(gè)候選內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增特異性Fig. 2 Primer amplication specificity of 6 candidate reference genes

表2 qRT-PCR中6個(gè)候選內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增效率和反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)Table 2 Primer amplification efficiency of 6 candidate reference genes in qRT-PCR and the correlation coefficient of the reaction standard curve

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

對(duì)6個(gè)候選內(nèi)參基因在不同器官和不同時(shí)期花瓣中的Ct值進(jìn)行匯總，通過(guò)OriginPro 9.1軟件預(yù)測(cè)候選內(nèi)參基因轉(zhuǎn)錄豐度，Ct值越小，表達(dá)豐度越高。由圖4A可知，在杜鵑紅山茶不同器官中，所有候選內(nèi)參基因的Ct值介于17～24之間，表明表達(dá)比較適中。GAPDH和EF1α的Ct值最低，分別處于17.85～21.73和19.32～23.04之間，表明這2個(gè)基因轉(zhuǎn)錄豐度最高。而TUA和TUB的Ct值最高，分別介于23.97～27.57和22.60～28.17之間，表明其轉(zhuǎn)錄豐度較低。由圖4B可知，在杜鵑紅山茶不同發(fā)育時(shí)期的花瓣中，所有候選內(nèi)參基因的Ct值均介于17～22之間，表明表達(dá)較適中。GAPDH的Ct值最低，介于17.60～19.48之間，表明該基因轉(zhuǎn)錄豐度最高。而TUA的Ct值最高，介于23.65～26.11之間，表明其轉(zhuǎn)錄豐度較低。

2.4 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

利用2個(gè)軟件分別評(píng)估6個(gè)候選內(nèi)參基因在杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中的表達(dá)穩(wěn)定性。

2.4.1 GeNorm分析 GeNorm算法是根據(jù)所有候選內(nèi)參基因的成對(duì)變異值來(lái)計(jì)算各基因的表達(dá)穩(wěn)定值M的，M值越小表明基因穩(wěn)定性越好，M＜1.5的候選內(nèi)參基因才可作內(nèi)參基因使用。GeNorm評(píng)估結(jié)果表明，6個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在不同器官中候選內(nèi)參基因的M值大小排序?yàn)椋篢UB＞EF1α＞Actin＞UBQ＞TUA＞GAPDH（圖5A），其中以GAPDH和TUA基因的穩(wěn)定性最好。在不同時(shí)期的花瓣中候選內(nèi)參基因的M值大小排序?yàn)椋篢UA＞EF1α＞Actin＞GAPDH＞TUB＞UBQ（圖5B），其中以UBQ和TUB的穩(wěn)定性最好。

利用GeNorm計(jì)算杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中的配對(duì)變異值，結(jié)果（圖6）表明，不同器官中V2/3值為0.148，不同時(shí)期花瓣中V2/3值為0.107，二者均小于0.15，因此，本試驗(yàn)所選的兩組樣品中最適內(nèi)參基因數(shù)目均為2個(gè)。

圖3 6個(gè)候選內(nèi)參基因在杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時(shí)期花瓣（B）中的熔解曲線Fig. 3 Melting curves of 6 candidate reference genes from different organs（A）and petals of different stages（B）of Camellia azalea

2.4.2 NormFinder分析 NormFinder算法是基于方差分析對(duì)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性進(jìn)行排序，并引入不同樣品組間表達(dá)差異。與GeNorm類似，候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值M越小，表達(dá)越穩(wěn)定。結(jié)果表明，在不同的器官中，6個(gè)候選內(nèi)參基因按照M值由高到低排列依次為：TUB＞EF1α＞UBQ＞Actin＞TUA＞GAPDH（圖7A），表明GAPDH最穩(wěn)定，其次為TUA和Actin。在不同時(shí)期的花瓣中，6個(gè)候選內(nèi)參基因按照M值由高到低排列依次為：EF1α＞TUA＞Actin＞GAPDH＞UBQ＞TUB（圖7B），表明TUB最穩(wěn)定，其次為UBQ和GAPDH。

2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選到的內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，選擇不同器官中穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因（TUA和GAPDH）和不同時(shí)期花瓣中穩(wěn)定性最好的內(nèi)參基因（TUB和UBQ），校準(zhǔn)CaGASA3基因的表達(dá)模式。結(jié)果（圖8）表明，在不同器官中，分別以TUA、GAPDH和TUA+GAPDH為內(nèi)參時(shí)，CaGASA3的表達(dá)模式趨勢(shì)一致，CaGASA3基因在杜鵑紅山茶的地上部分表達(dá)均較高；不同時(shí)期花瓣中，分別以UBQ、TUB和UBQ+TUB為內(nèi)參時(shí)，CaGASA3在花瓣發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)模式趨勢(shì)相同，均在S4期表達(dá)量達(dá)到最高。通過(guò)CaGASA3基因的表達(dá)模式分析，進(jìn)一步證明了TUA和GAPDH為不同器官中適用的內(nèi)參基因，TUB和UBQ為不同時(shí)期花瓣中適用的內(nèi)參基因。

圖4 6個(gè)候選內(nèi)參基因在杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時(shí)期花瓣（B）中的Ct值Fig. 4 Ct values of 6 candidate reference genes in different organs（A）and petals of different periods（B）of Camellia azalea

圖5 GeNorm分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig. 5 Gene expression stability of the candidate reference genes calculated by GeNorm

圖6 GeNorm分析最佳內(nèi)參基因數(shù)目Fig. 6 Number of optimal reference genes calculated by GeNorm

圖7 NormFinder分析內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig. 7 Expression stability of the candidate reference genes calculated by NormFinder

圖8 CaGASA3在杜鵑紅山茶不同器官（A）和不同時(shí)期花瓣（B）中的表達(dá)模式分析Fig. 8 Expression analysis of CaGASA3 in different organs（A）and petals of different periods（B）of Camellia azalea

3 討論

qRT-PCR技術(shù)是目前最常用的基因功能分析方法，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)基因功能的前提是篩選出合適的內(nèi)參基因［17-26］。GeNorm［15］和NormFinder［16］是qRT-PCR內(nèi)參篩選中兩種常用的評(píng)估程序，已在多種植物中廣泛應(yīng)用。利用這些方法，Dai等［4］篩選出不同脅迫條件下適用于桑樹的內(nèi)參基因；Saddhe等［8］篩選出不同鹽脅迫條件下適用于紅樹的內(nèi)參基因；Da Silva等［7］篩選出適用于甘薯不同組織中的內(nèi)參基因；Nong等［5］篩選出適用于不同脅迫條件下火龍果中的最佳內(nèi)參基因。通常，看家基因在不同組織器官中具有穩(wěn)定的表達(dá)水平，但它們的轉(zhuǎn)錄水平在不同條件下會(huì)有相應(yīng)變化［6,27］。因此，篩選出適用于不同研究目的的內(nèi)參基因非常重要。

本研究選擇了6種看家基因作為候選內(nèi)參基因，通過(guò)GeNorm和NormFinder評(píng)估了6個(gè)候選基因表達(dá)的穩(wěn)定性，并利用CaGASA3基因的表達(dá)模式驗(yàn)證了所選內(nèi)參基因的可靠性，最終得出在杜鵑紅山茶不同器官中的最佳內(nèi)參基因?yàn)門UA和GAPDH，在杜鵑紅山茶不同時(shí)期花瓣中的最適內(nèi)參基因?yàn)門UB和UBQ。內(nèi)參基因 α-Tubulin（TUA）編碼的 α 微管蛋白是細(xì)胞骨架的基礎(chǔ)成分，在進(jìn)化上具有較高的保守性，在許多物種中均能穩(wěn)定表達(dá)［20］。GAPDH是糖酵解、糖異生及光合作用碳循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在紅球姜21和彩色馬蹄蓮［19］中均表達(dá)穩(wěn)定。TUB2編碼的β-微管蛋白在桑樹［4］中表達(dá)穩(wěn)定。UBQ可在紅球姜［21］、黃杜鵑［22］和火龍果［5］等植物中表達(dá)穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明，在杜鵑紅山茶不同器官和不同時(shí)期花瓣中的最適內(nèi)參基因是不同的。鑒于不同的環(huán)境條件，如非生物脅迫和生物脅迫都會(huì)影響內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性，今后將對(duì)杜鵑紅山茶的不同脅迫條件下內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)GeNorm和NormFinder對(duì)杜鵑紅山茶中6個(gè)候選qRT-PCR內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。由GeNorm程序評(píng)估得到不同器官中6個(gè)基因的穩(wěn)定性排名為：GAPDH＞TUA＞UBQ＞Actin＞EF1α＞TUB，不同時(shí)期花瓣中6個(gè)基因的穩(wěn)定性排名為：UBQ＞TUB＞GAPDH＞Actin＞EF1α＞TUA；由NormFinder程序評(píng)估得到不同器官中6個(gè)基因的穩(wěn)定性排名為：GAPDH＞TUA＞Actin＞UBQ＞EF1α＞TUB，不同時(shí)期花瓣中6個(gè)基因的穩(wěn)定性排名為：TUB＞UBQ＞GAPDH＞Actin＞TUA＞EF1α。利用GeNorm計(jì)算配對(duì)變異值表明，不同器官和不同時(shí)期花瓣中最適內(nèi)參基因數(shù)目均為2個(gè)，因此，杜鵑紅山茶不同器官中最適內(nèi)參基因?yàn)門UA和GAPDH，而不同時(shí)期花瓣中最適內(nèi)參基因?yàn)門UB和UBQ。