張琳琳，黃仲萍，陳樑，陳玉

卵巢癌是指發(fā)生于卵巢的女性惡性腫瘤，其中約90%腫瘤來(lái)源于上皮，即上皮性卵巢癌(EOC)[1]。早期EOC難以發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期卵巢癌，預(yù)后極差[2]。流行病學(xué)研究顯示[3]，早期EOC 5年生存率高達(dá)90%，而晚期僅為20%～30%，患者生活質(zhì)量嚴(yán)重降低。目前臨床以病理活檢為診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但其技術(shù)要求高，依從性低[4]。彩色超聲在臨床篩查盆腔腫塊等具有重要的作用，其可在檢查卵巢組織、細(xì)胞血流變化的同時(shí)檢測(cè)卵巢的大小和形態(tài)變化等，進(jìn)而診斷EOC，但其診斷方式有一定的局限性，需綜合受檢者體型、腹壁厚薄、腫塊深淺及膀胱充盈程度等因素[5]。微小RNA(miRNA)在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡等方面具有重要的作用，且miR-191和miR-21在EOC中異常表達(dá)，其有望成為診斷EOC的新型血漿學(xué)指標(biāo)[6-7]。為彌補(bǔ)單一方式診斷效能不足，現(xiàn)研究彩色超聲聯(lián)合血漿miR-191、miR-21測(cè)定對(duì)上皮性卵巢癌的診斷效能，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月—2020年2月四川省綿竹市人民醫(yī)院婦科收治EOC患者60例作為卵巢癌組，另外選取同期在醫(yī)院治療的上皮卵巢良性腫瘤患者60例為良性組，健康體檢者60例為健康對(duì)照組。卵巢癌組年齡44～60(52.10±2.86)歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)16.00～28.14 (22.07±2.35)kg/m2；臨床分期以國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期為標(biāo)準(zhǔn)[8]，Ⅰ期21例，Ⅱ期14例，Ⅲ期23例，Ⅳ期2例；病理類型：漿液性癌36例，透明細(xì)胞癌15例，黏液性癌9例。良性組年齡44～60(51.87±2.91)歲；BMI 16.27～28.09(22.18±2.29)kg/m2。健康對(duì)照組年齡44～60(52.05±2.89)歲；BMI 16.15～27.81(21.98±2.26)kg/m2。3組受試者年齡及BMI等基線資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理組織活檢確診為EOC[9]；未經(jīng)過(guò)卵巢癌手術(shù)治療、化療及放療等系統(tǒng)治療；近1個(gè)月內(nèi)未服用激素或避孕類藥物；可正常溝通交流者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：并發(fā)自身免疫疾病、嚴(yán)重感染及重大手術(shù)創(chuàng)傷者；并發(fā)其他惡性腫瘤者；妊娠期或哺乳期患者；毒品或酒精濫用者；不配合研究者。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 彩色超聲檢查：應(yīng)用美國(guó)GE Voluson E10四維彩色超聲儀，受檢者平臥于檢測(cè)床，檢測(cè)時(shí)先行腹部彩色超聲檢測(cè)，探頭頻率為3.5 MHz，對(duì)腫塊或包塊直徑不足5 cm或未能識(shí)別的包塊，需行陰道彩色超聲檢測(cè)，探頭頻率為5～7 MHz，密切觀察腫瘤壁位置、分隔、回聲及血流狀況等影像學(xué)特征，以確定腫瘤包塊良性或惡性。

1.3.2 血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平檢測(cè)：于受試者入組時(shí)采集空腹外周靜脈血4 ml，于4 ℃ 離心后將上清(血漿)分裝到1.5 ml的離心管(離心管經(jīng)無(wú)RNA酶處理)中。再次于4 ℃離心去除殘余細(xì)胞，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中，即得所需血漿，-20℃溫度條件下保存?zhèn)溆?，?yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定血漿miR-191和miR-21。手術(shù)過(guò)程中取出新鮮的上皮性卵巢癌組織標(biāo)本50 mg，用研棒碾碎后應(yīng)用美國(guó)invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑提取EOC組織總RNA，同時(shí)使用NanoDrop one超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度，波長(zhǎng)選擇260 nm和280 nm，吸光度比值 1.8～2.0，將RNA逆轉(zhuǎn)錄后行PCR檢測(cè)法。引物具體序列如下，miR-191上游引物：5’- ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT-3’，下游引物：5’- CGGGGTACCATCAGAGTGGCCCCGATAAAGTA-3’；miR-21上游引物：5’-GCGGTAGCTTATCAGACTGA -3’,下游引物：5’-TGCGTGTCGTGGAGTC -3’；U6上游引物：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，采用CFX384Touch型號(hào)定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件： 95℃、5 min，95℃、15 s，60℃、20 s和72℃、30 s，擴(kuò)增循環(huán)40次后行熔解曲線相關(guān)分析，每組數(shù)據(jù)各測(cè)定3次，取平均值。miR-191和miR-21表達(dá)均以U6為參數(shù)值，得到△Ct值，2-△△Ct即為miR-191和miR-21的相對(duì)值。血漿腫瘤指標(biāo)診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)ROC曲線最佳臨界值，高于臨界值則判定為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢癌組和良性組彩色超聲結(jié)果比較 卵巢癌組和良性組病變直徑比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在質(zhì)地、形狀、位置及包膜完整度等方面比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 卵巢癌組和良性組彩色超聲影像學(xué)結(jié)果比較 [例(%)]

2.2 3組血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平比較 血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平比較，卵巢癌組>良性組>健康對(duì)照組(P均<0.01)， 見(jiàn)表2。

表2 3組血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平比較

2.3 卵巢癌組不同腫瘤分期血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平比較 卵巢癌組血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平隨著腫瘤分期提高而增加 (P均<0.05)， 見(jiàn)表3。

表3 卵巢癌組不同腫瘤分期血漿miR-191和miR-21表達(dá)水平比較

2.4 各指標(biāo)對(duì)卵巢癌診斷價(jià)值的ROC曲線分析 ROC曲線分析結(jié)果表明，彩色超聲診斷EOC的AUC為0.748(95%CI0.687～0.808)；血漿miR-191 截?cái)嘀禐?.67，AUC為0.595(95%CI0.519～0.671)；血漿miR-21 截?cái)嘀禐?.55，AUC為0.703(95%CI0.632～0.773)；在最佳臨界切點(diǎn)時(shí)，三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.848(95%CI0.801～0.895) 。聯(lián)合檢測(cè)診斷EOC的效能高于各指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表4。

圖1 彩色超聲、miR-191與miR-21單項(xiàng)檢測(cè)及

表4 彩色超聲、miR-191和miR-21單項(xiàng)檢測(cè)及聯(lián)合檢測(cè)診斷EOC效能分析

3 討 論

EOC是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有隱匿性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移侵襲性高及預(yù)后差等特征，早期臨床癥狀不顯著，而中晚期會(huì)出現(xiàn)腹部劇烈疼痛、胃腸道紊亂、腹腔積液、乏力和消瘦，甚至發(fā)生顱內(nèi)轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅患者生命安全[10]。EOC病因較為復(fù)雜，主要與遺傳、激素分泌異常及性生活紊亂等相關(guān)[11]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)展，臨床醫(yī)師和學(xué)者對(duì)EOC疾病的診斷和評(píng)估進(jìn)行深層次探討，常見(jiàn)的EOC診斷方式為影像學(xué)、病理活檢和血漿學(xué)指標(biāo)[12]，其中病理檢測(cè)專業(yè)度高、價(jià)格昂貴、有創(chuàng)傷，影像學(xué)侵入性低、檢測(cè)方便、費(fèi)用低廉，而血漿腫瘤標(biāo)志物為診斷選擇的熱點(diǎn)。為避免影像學(xué)的局限性，并彌補(bǔ)單一指標(biāo)診斷效能不足，本研究將彩色超聲、血漿miR-191和miR-21聯(lián)合檢測(cè)，并應(yīng)用ROC曲線評(píng)估其單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)的診斷效能，旨在為臨床研究提供依據(jù)。

彩色超聲是女性婦科疾病診療的常見(jiàn)方式，其不僅可測(cè)量腹部腫塊直徑，而且還可觀察腫瘤形態(tài)、包膜完整度、腹水及壁厚等影像學(xué)特征，并根據(jù)腫塊的質(zhì)地、包膜及邊界等特異性特征區(qū)分腫塊性質(zhì)[13]。研究表明[14]，良性瘤塊呈膨脹生長(zhǎng)趨勢(shì)，質(zhì)地均勻，囊腫分隔，囊壁厚薄一致，以完整包膜和囊性回聲為主，同時(shí)腫塊后面伴有增強(qiáng)回聲效應(yīng)；卵巢癌等惡性腫瘤為侵襲性生長(zhǎng)形態(tài)，腫塊及其邊界不規(guī)則，囊壁粗糙，且后方聲影信號(hào)降低，并伴有腹水。本研究中，彩色超聲檢查結(jié)果顯示，卵巢癌組和良性組腫物直徑比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在質(zhì)地、形狀、位置及包膜完整度等方面比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與文獻(xiàn)研究相符；同時(shí)ROC曲線分析結(jié)果顯示，彩色超聲敏感度為68.33%，特異度為70.00%，AUC為0.748(95%CI0.687～0.808)，與朱曉玲等[15]敏感度76.40%和特異度76.47%的研究結(jié)果相近，單獨(dú)彩色超聲技術(shù)診斷效能較低，分析認(rèn)為，彩色超聲檢測(cè)時(shí)易受腸道氣體、腫塊大小、膀胱充盈及肥胖程度等因素干擾而造成誤診或漏診等現(xiàn)象，因而需聯(lián)合其他檢測(cè)手段，以提高EOC陽(yáng)性檢出率[16]。

MiRNAs是一類長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，對(duì)約30%人類蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，可通過(guò)特異性匹配而干擾mRNA的正常轉(zhuǎn)錄、翻譯過(guò)程，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控靶基因的功能。研究表明[17]，miRNAs可在調(diào)節(jié)原癌和抑癌基因的基礎(chǔ)上介導(dǎo)新生血管生成、免疫功能逃逸及細(xì)胞轉(zhuǎn)移等途徑，進(jìn)而促進(jìn)癌癥的發(fā)生進(jìn)程。同時(shí)，miRNA在外周血中穩(wěn)定存在，并可抵制強(qiáng)酸、強(qiáng)堿及反復(fù)凍融等惡劣保存條件，可成為潛在的腫瘤標(biāo)志物。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，miR-191和miR-21與多種類型惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，二者在胃癌、肺癌及肝癌等癌癥中發(fā)揮重要作用，高桂卿等[18]研究證實(shí)，miR-191在卵巢癌患者中呈異常升高狀態(tài)，可應(yīng)用于EOC的臨床診斷；而郝文濤等[19]研究60例卵巢癌患者結(jié)果表明，EOC組患者血漿miR-21明顯高于良性組和健康對(duì)照組，且與臨床分期和組織分化有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，3組受試者血漿miR-191和miR-21水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢癌組和良性組血漿miR-191和miR-21明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且卵巢癌組明顯高于良性組(P<0.05)，證實(shí)miR-191和miR-21在EOC診斷中的重要價(jià)值。進(jìn)一步比較二者診斷效能，發(fā)現(xiàn)血漿miR-191診斷的臨界值為1.67，其敏感度為61.67%，特異度為58.33%，而高桂卿等[18]研究表明，miR-191診斷EOC敏感度為84.7%和特異度83.0%，顯著高于本結(jié)果，可能與樣本量、樣本來(lái)源有關(guān)，同時(shí)miR-191可在胃癌、肝細(xì)胞癌等中異常表達(dá)，單一診斷EOC效能較低。血漿miR-21診斷的臨界值為1.55，其敏感度為65.00%，特異度為65.00%，其高表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等病理特征相關(guān)，與曾玉等[20]研究的敏感度68.33%和特異度78.57%相近。

結(jié)合單一診斷分析結(jié)果，本研究進(jìn)一步對(duì)彩色超聲聯(lián)合miR-191和miR-21的診斷效能進(jìn)行評(píng)價(jià)，其敏感度和特異度分別為80.00%和58.33%。相較于單一彩色超聲技術(shù)，敏感度由68.33%提高到80.00%，較好的彌補(bǔ)了彩色超聲診斷的漏診率。另外，聯(lián)合診斷AUC為0.848，明顯高于影像學(xué)單獨(dú)診斷的0.748，miR-191診斷的0.595和miR-21診斷的0.703，結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)能在顯著提高診斷敏感度的基礎(chǔ)上保持較高的特異度和準(zhǔn)確度，血漿腫瘤標(biāo)志物miR-191和miR-21在一定程度上彌補(bǔ)了影像學(xué)不典型而導(dǎo)致的漏診，從彩色超聲及血漿標(biāo)志物等多方面進(jìn)行綜合診斷，以提高診斷效能。

綜上所述，彩色超聲聯(lián)合血漿miR-191和miR-21，可有效提高上皮性卵巢癌診斷的敏感度，并保持較高的特異度和準(zhǔn)確度，可彌補(bǔ)影像學(xué)的局限性，為早期診斷提供思路。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

張琳琳：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫；黃仲萍：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;陳樑、陳玉：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，課題設(shè)計(jì)，論文撰寫