張 潔，程 昊，田 佶，張 杰，姚允聰

(農業(yè)應用新技術北京市重點實驗室/植物生產國家級實驗教學示范中心/北京農學院 植物科學技術學院，北京102206)

觀賞海棠[1]是蘋果屬植物中具有較好觀賞價值的植物之一。在中國分布廣泛，其花、果、葉均具有極高的觀賞價值。根據海棠花瓣的顏色，可將其分為紅花、粉化和白花3種[2]。具有代表性的分別是‘王族’、‘印第安魔力’和‘當娜’。

花青素對植物顏色產生重要的影響[3]?；ㄇ嗨氐慕M分及其比例是影響花朵顏色的重要原因[4]。在植物體內，花青素通過與各種單糖結合形成糖苷，因此稱為花色苷(Anthocyanin)[5]。根據文獻報道，影響植物花色苷合成的基因分兩類，一類是保守的結構基因，直接編碼參與花色苷生物合成的酶[6]。另一類是調節(jié)基因，調節(jié)結構基因的表達過程和含量以及花色苷的積累[7]。

MicroRNA (miRNA) 是一類內源的調節(jié)基因表達的小RNA，長度在19～25個核苷酸(nt)[8]。miRNA在植物中的調節(jié)作用有研究表明，在擬南芥中，miR828通過靶向調節(jié)花色苷合成的轉錄因子PAP1，PAP2和MYB113，從而負調控花色苷的積累[9]。高表達miR828通過抑制轉錄因子MYB75, MYB82, MYB90和MYB113從而減少花色苷的積累[10]。缺磷會導致植物中花色苷的積累，miR399d在缺磷條件下通過其靶基因和下游相關基因對花色苷進行了調節(jié)[11]。miR156是眾多研究者研究的熱點，miR156通過靶向負調節(jié)花色苷的SPL轉錄因子，進而調控花色苷的積累[12]。在蘋果果皮的光照著色研究中，MLNC3.2和MLNC4.6對miR156a具有內源性靶點模擬的作用，在光誘導花青素生物合成過程中可以阻止miR156a對SPL2-like和SPL33的裂解[13]。

花色苷是影響花瓣顏色重要的物質之一。本研究擬以不同品種海棠為試材，對其花瓣進行miR156a前體基因克隆進行序列比較，并通過分光光度法測量花瓣的花色苷含量以及qRT-PCR方法測定miR156a的相對表達量，以揭示miR156a對觀賞海棠花瓣花色苷形成的調控作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

材料是2019年春天采集的北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)蔣各莊村有機觀光蘋果園中自然生長的‘王族’、‘印第安魔力’和‘當娜’3個品種的海棠花瓣，分4個時期取樣，分別命為小蕾、大蕾、初花和盛開。采后先在冰盒里存樣，迅速用液氮凍存，存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 提取植物RNA及反轉錄 miRNA采用艾德萊EASYspin多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒，提取海棠花瓣的RNA。采用全式金miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反轉miRNA。兩步法反轉基因克隆使用的cDNA。

1.2.2 pre-miR156a基因克隆 由于蘋果和海棠同屬于蘋果屬植物，使用GDR找到金冠的pre-miR156a的基因序列，查到該序列在15號染色體上。在前體序列的上游和下游各取200 bp左右的序列，構成一段400～500 bp的基因序列。通過Primer5軟件設計引物。正向引物McmiR156a-F：5’-ATCCTGGTAGATAAGGGCAT-3’；反向引物McmiR156a-R：5’-GTTGGGAGAAAAACACCTGG-3’。以花瓣cDNA為模板，反應體系為：cDNA模板2 μL、McmiR156a-F 1.5 μL、McmiR156a-R 1.5 μL、擎科生物金牌Mix 45 μL。反應條件為：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火溫度10 s，72 ℃延伸時間5 s，30 cycles，72 ℃總延伸2 min，4 ℃保存。

將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收目對應位置的基因片段條帶，膠回收試劑盒使用艾德萊瓊脂糖凝膠純化試劑盒。膠回收產物連接全式金pEASY-Blunt載體，轉Trans-T1大腸感受態(tài)，涂板，挑菌，菌液PCR，將PCR產物條帶正確的菌液送測序。

1.2.3 qRT-PCR qRT-PCR選擇大連寶日醫(yī)生物技術有限公司SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)酶進行試驗，試驗體系參照說明書。采用qRT-PCR兩步法( 95 ℃預變性3 min，94 ℃變性20 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，39次循環(huán))為反應條件，以U6作為內參基因，miR156a的熒光引物為miR156a成熟體序列，檢測miR156a的相對表達量。待測樣品的數據均進行3次生物學重復。

1.2.4 分光光度法測花色素苷含量 將花瓣在液氮中研磨成細粉，稱取0.1 g樣品，用植物花色苷提取試劑盒提取花色苷。用分光光度計分別測量提取液在530 nm處和700 nm處的吸光度值，運用公式計算得到花色苷含量。

1.2.5McmiR156a的靶基因預測 通過靶基因預測網站psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/)對McmiR156a的靶基因進行了預測，通過NCBI比對，找到該基因的詳細描述。

2 結果與分析

2.1 3 種海棠花瓣花色比較 通過照片可以看出，隨著生長時期的增加，花瓣顏色逐漸變淺(圖1)，王族花瓣顏色逐漸變淺，在盛開時期，花朵依然紅艷。印第安魔力花瓣顏色由紅逐漸變粉，而當娜花瓣最初是粉紅色，當生長到初花時期幾乎為白色，盛開時全白。3種花瓣花色苷含量也呈現出明顯的降低趨勢(圖2)，同一時期3個品種的花瓣花色苷含量也出現了顯著差異，王族花色苷含量最多，當娜花瓣花色苷含量最少。

圖1 3種海棠花瓣表型圖

注：每組數據顯示為平均值 SE (n=3)。不同的小寫字母表示同一品種不同時期數據差異在P <0.05，不同的大寫字母表示同一時期不同品種數據差異在P <0.05

2.2 3種海棠花瓣miR156a基因比較

以3種海棠花瓣cDNA為模板，進行miR156a基因克隆，得到長度為489 bp的加保護堿基的前體序列(圖3)。miR156具有保守性，通過將3個品種的序列測序后與金冠miR156a前體序列進行比較，發(fā)現3個品種海棠花瓣中miR156a前體90 bp序列沒有差異(圖4)。

圖3 miR156a前體PCR擴增產物

圖4 miR156a前體序列比對

2.3 McmiR156a靶基因預測結果

通過靶基因預測網站psRNATarget對miR156a靶基因進行預測，篩選得到以下與其高度互補并且假陽性低的靶基因(表1)。分析發(fā)現miR156a靶基因多為SPL家族，通過NCBI網站查詢得到靶基因序列，并對其做互補性分析。發(fā)現SPL6(Squamosa promoter binding like 6)基因只有一個堿基不匹配，不匹配堿基為U-G，剩余靶基因歲雖也是一個堿基不匹配，但不匹配堿基為U-U，相對的期望值要大。

2.4 3種海棠花瓣中miR156a相對表達量比較

以3種海棠花瓣為模板，提取miRNA，通過熒光定量PCR的方法，計算miR156a的相對表達量。

表1 miR156a靶基因預測結果

通過分析可以看出，隨著花瓣顏色變淺，miR156a的相對表達量逐漸升高，并且3種不同顏色的花瓣中，王族的miR156a相對表達量較低，其余兩種較高，在顏色變化明顯的印第安魔力花瓣中4個時期miR156a的相對表達量呈現顯著差異(圖5)。說明miR156a在花色苷生物合成中起到了負調控的作用。

注：每組數據顯示為平均值 SE (n=3)。不同的小寫字母表示同一品種不同時期數據差異在P <0.05，不同的大寫字母表示同一時期不同品種數據差異在P <0.05

3 討 論

觀賞海棠是中國極具綜合觀賞價值的植物。其花果葉均具有觀賞價值。影響植物顏色的重要物質之一是花色苷，花色苷不僅能夠讓植物色彩艷麗，便于授粉和傳播種子，又能抵御害蟲侵襲[14]，減少植物受到紫外線傷害。同時對人體有許多有益功效，比如抑制脂質過氧化、保護視力、預防糖尿病、保護肝臟和清除體內自由基等[15]?；ㄉ諛O其不穩(wěn)定并且在不同生長時期，花色苷含量也不相同[16]。在本研究中，隨著植物的生長，花瓣中花色苷的含量逐漸降低。因此如何提高花色苷的生物合成量，降低花色苷的降解，需要更深入的研究。

研究者常使用基因調控的方法可以使花色苷生物合成增多。蘋果中MdHY5受光照和脫落酸誘導，在蘋果愈傷組織中高表達HY5，可以調節(jié)MYB10基因和下游花青素生物合成基因的表達，從而促進花青素的積累[17]。miRNAs是一類負調控基因表達的非編碼小RNA，有研究表明，葡萄中，miR828和miR858抑制靶基因MYB114從而促進花青素的生物合成[18]。獼猴桃果實測序中發(fā)現miR858高度表達可抑制MYBC1基因的表達，而MYBC1可與LDOX基因的啟動子結合，從而抑制獼猴桃果實花青素的生物合成[19]。植物發(fā)育中miR156-SPL模塊廣為研究，在柑橘的愈傷組織中，miR156-SPL被增強可以增加愈傷組織對硒的調控能力，從而促進愈傷組織的生物學進程[20]。miR156/miR157通過控制SPL基因的變化來調節(jié)擬南芥營養(yǎng)期的轉變[21]。擬南芥中miR156e-3p的高表達抑制SPL1的轉錄水平，從而促進DFR的高表達使得擬南芥中花色苷積累[22]。

通過研究發(fā)現，不同顏色海棠花瓣中miR156a的相對表達量不同，顏色深的miR156a表達量低，顏色淺的表達量高。本研究結果對miR156a及靶基因SPL對花色素苷的具體調控作用提供一定的理論基礎。