韓 蕊, 王思涵, 張 先, 李范洙
(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)
寒蔥(Allium Victorialis L.)學(xué)名茖蔥,別名旱蔥、鹿耳蔥,為百合科多年生草本植物[1],多鱗莖長橢圓形,鱗莖皮成絲網(wǎng)狀,葉具長柄,長卵形或長橢圓形,全緣,質(zhì)軟而平滑,稍帶粉白色,平行脈。主要分布在東北的長白山地區(qū)和大小興安嶺,生于陰濕山坡、林下、草地或溝邊,地上部植株可供食用[2],具備獨(dú)特的大蒜、韭菜和大蔥等風(fēng)味,作為山野菜鮮食或做成腌制菜被廣為食用。
寒蔥營養(yǎng)豐富,鮮葉中蛋白質(zhì)含量約4%,Vc含量250 mg/100g,脂肪含量0.4 mg/100g,還含有豐富的礦物質(zhì)[3-5]。且寒蔥中含有多種活性成分,主要為含硫化合物、黃酮類化合物、甾體化合物、皂苷等[6],對寒蔥提取物或活性成分功能性研究結(jié)果表明,寒蔥具有良好的抗氧化和抗菌活性[7-9]、抗動(dòng)脈硬化[10]、降血脂和降膽固醇作用[11],并且黃翠菊[12]研究發(fā)現(xiàn),寒蔥提取物對酒精導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有良好的保護(hù)作用。雖然對寒蔥化學(xué)成分及活性研究有了一定的進(jìn)展,但對寒蔥深加工方面的研究寥寥無幾。該文探討了利用寒蔥提取物制備咀嚼片的工藝,并進(jìn)一步研究了寒蔥咀嚼片對急性肝損傷的輔助保護(hù)作用,為寒蔥保健食品的開發(fā)提供有效的依據(jù)。
1) 寒蔥 于2018年采自吉林省延邊地區(qū)的野生寒蔥;乳糖、糊精、甘露醇、MCC均為食品級。
2) 雄性小鼠 33只昆明鼠,月齡約4月,體重(28±4.5) g,購于吉林省延邊大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。將小鼠飼養(yǎng)在干凈、環(huán)境適宜的代謝籠里,溫度保持在22 ~26 ℃,濕度約40%~50%,自然光照,定期更換便料,自由飲食。
3) 試劑 蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品、色譜級甲醇購自sigma 公司;ALT試劑盒、AST試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;水飛薊素購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司;四氯化碳購自天津格里斯醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司。
1) HP 1100高效液相色譜系統(tǒng) 配有可變波長紫外檢測器和Rev.A.06.03色譜工作站,美國惠普公司。
2) 質(zhì)構(gòu)儀 TMS-PR,美國FTC公司。
3) 片劑脆碎度測定儀 CS-2,天津天河分析儀器有限公司。
取寒蔥鮮葉1 kg,用15 L蒸餾水浸泡24 h后回流提取2 h,過濾;過濾后的濾渣加入10 L蒸餾水中2次回流提取1 h,過濾;所得濾渣加入5 L蒸餾水中再次回流提取30 min,過濾;合并3次濾液,減壓濃縮至浸膏狀,將所得浸膏冷凍干燥,粉碎,過120目篩備用。
1) 色譜條件 色譜柱:C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流動(dòng)相:0.3%磷酸-甲醇(35∶65);檢測波長:360 nm;流速:1 mL/min;循環(huán)時(shí)間:40 min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:40℃。
2) 供試溶液制備 蘆丁、槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級甲醇溶液配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。精密秤取寒蔥提取物100 mg,加入1 mL色譜級甲醇超聲加熱溶解,待冷卻,離心后過0.45 μm的微孔濾膜,得到供試樣品溶液。
1) 咀嚼片制備工藝流程 該試驗(yàn)采用濕法制粒的方法制備咀嚼片[13-15],在原輔料經(jīng)潤濕劑70%乙醇粘合后進(jìn)行濕法制粒。制備工藝流程如下:
寒蔥粉、填充劑→混合→制濕?!稍铩!鷫浩善?/p>
2) 咀嚼片填充劑種類和比例的篩選 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取的填充劑以乳糖為主,并用糊精或者M(jìn)CC(微晶纖維素)作為復(fù)配。該實(shí)驗(yàn)中,控制寒蔥提取物的添加量為10%,其余部分用填充劑按照不同的比例補(bǔ)足[16]。
3) 寒蔥提取物添加量的篩選 寒蔥提取物為黃褐色,寒蔥的特征味濃郁,黏性較大,在使用過程中需考察其用量。主要通過感官評價(jià)以及硬度指標(biāo),篩選出寒蔥提取物的適宜添加量。
4) 甘露醇添加量的篩選 為掩蓋寒蔥提取物的刺激性氣味,增強(qiáng)寒蔥提取物咀嚼片的可食性,添加一定量的甘露醇,用于調(diào)整咀嚼片的口感味道。通過感官評價(jià)以及硬度指標(biāo),確定適宜的添加量。
5) 殺菌工藝的研究 采用微波、紫外線、臭氧及其復(fù)配的處理,對壓片前的顆粒進(jìn)行殺菌處理,同時(shí)設(shè)置空白處理組,測定咀嚼片的菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。
6) 咀嚼片的質(zhì)量檢查 按照中國藥典的相應(yīng)規(guī)定對咀嚼片的片重差異限度、硬度和脆碎度進(jìn)行測定。
7) 指標(biāo)的測定方法 ①硬度的測定:用質(zhì)構(gòu)儀測定片劑硬度。具體參數(shù)如下:預(yù)測試速度1 mm/s;觸發(fā)力5.0 g;測試速度2 mm/s;返回速度5.0 mm/ s;測試距離1 mm;測試周期1。②休止角的測定:取壓片前的顆粒5 g,自具0.75 cm小孔的漏斗中距平板玻璃平面10 cm高度落于玻璃平面上,測定堆積高度(H)和堆積半徑(r),并按tanφ=H/r求出休止角φ,以φ表示顆粒的流動(dòng)性,φ ≤30°且φ愈小,流動(dòng)性愈好[17]。③片重差異限度測定:隨機(jī)取10片寒蔥咀嚼片,用分析天平精確稱每片的質(zhì)量,即片重差異= (每片片重-平均片重) /平均片重×100%。 ④脆碎度的測定:取若干片咀嚼片使其總重約為6.5 g,用吹風(fēng)機(jī)吹去片劑脫落的粉末,精密稱重,置片劑脆碎度測定儀筒中,轉(zhuǎn)動(dòng)100次。取出,同法除去粉末,精密稱重, 計(jì)算減失重量百分比[18],即為脆碎度。⑤菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)的測定:按照GB4789.2-2010和GB4789.3-2010中的方法分別測定菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。
8) 感官評價(jià)方法及標(biāo)準(zhǔn) 由從事食品專業(yè)的人員組成10人評定小組,主要針對寒蔥咀嚼片口感、味道、組織形態(tài)進(jìn)行評定[19],評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示,按照相應(yīng)權(quán)重計(jì)算感官評分,取平均值。
表1 寒蔥咀嚼片感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory quality scoring standards for Allium Victorialis chewable tablets
1.6.1 小鼠急性肝臟損傷模型的建立
將雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,之后隨機(jī)把33只小鼠分為正常組(n=5)、模型組(n=10)、陽性組(n=9)、咀嚼片組(n=9)。每天早上8點(diǎn)對小鼠經(jīng)口灌胃,正常組與模型組每日灌胃等體積的生理鹽水,陽性組、咀嚼片組灌胃劑量分別為0.1 g/kg·d和3 g/kg·d,連續(xù)灌胃30 d后,除正常組外其余各組腹腔注射10%四氯化碳2 mL/kg[20]。陽性組所用藥物為水飛薊素。
1.6.2 小鼠肝臟系數(shù)的測定
腹腔注射四氯化碳16 h后,對各組小鼠經(jīng)眼球取血后,頸椎脫臼處死小鼠,迅速取出肝臟,置于4 ℃生理鹽水中洗去殘血并除去表面結(jié)締組織,濾紙吸凈表面水分后,采用精密天平稱取各組織濕重并記錄;稱重之后,部分肝臟浸泡于10%的甲醛中,部分冷存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
肝臟系數(shù)計(jì)算方法:肝臟系數(shù)=肝臟重量/體重×100%
1.6.3 小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的測定
1) 血清的采集 腹腔注射16 h后,對各組小鼠進(jìn)行摘除眼球取血,采血時(shí)間為上午9:00~11:00。每只采血量5~10 mL,靜置4 h以上,待血液凝固、纖維蛋白收縮后于15 mL離心管中,利用離心機(jī)在4 000 r/min條件下離心10 min,取上層血清約1 mL,平均分放在4個(gè)EP管,貼好標(biāo)簽,最后將血清樣本儲藏于-20 ℃冰箱。
2) 轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測 血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的測定按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行操作。
1.6.4 小鼠肝臟組織形態(tài)的觀察
將各組小鼠肝臟取出清洗后,先放在培養(yǎng)皿的中心,然后把培養(yǎng)皿放在標(biāo)準(zhǔn)紙上,讓培養(yǎng)皿與已標(biāo)定的兩條互相垂直的線相切,然后進(jìn)行拍照,每個(gè)樣品拍3張照片。
1.6.5 小鼠肝臟組織病理的觀察
各組小鼠肝臟先放入10%的甲醛溶液里浸泡4 d,浸泡后肝臟組織切成3 mm2大小,脫水,利用石蠟包埋機(jī)完成灌蠟操作,然后切片機(jī)切成5 μm薄片,最后進(jìn)行HE染色。制作好的肝臟切片置入光學(xué)顯微鏡(Ti2,日本尼康公司)下觀察即可。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphab Prism program5.0的軟件處理,采用Column方法進(jìn)行數(shù)據(jù)間的顯著性分析,以*(P<0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)表示顯著性差異。
黃酮類化合物是植物源天然次生代謝產(chǎn)物, 是蔥屬植物中的一種重要的生物活性物質(zhì),蔥屬黃酮以蘆丁、槲皮素與山奈酚為主[21]。因此采用HPLC法對寒蔥提取物中黃酮類化合物進(jìn)行了分析。由圖1可以看出,在寒蔥提取物中檢測出蘆丁、槲皮素、山萘酚這3種成分,這3種物質(zhì)的含量分別為4.997、0.695和2.481 μg/g,蘆丁含量最多,其次是山奈酚,槲皮素含量最低(表2)。
圖1 寒蔥提取物與蘆丁、槲皮素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分析圖Fig.1 The chromatographic analysis diagram of the extract of Allium Victorialis and the standard solution of rutin, quercetin and kaem pferol
表2 寒蔥提取物中黃酮類物質(zhì)含量
2.2.1 填充劑的篩選
該試驗(yàn)中選用寒蔥提取物為原料進(jìn)行咀嚼片的制備,由于寒蔥提取物經(jīng)水提取,濃縮,干燥,其形態(tài)和成分發(fā)生了較大的改變,因此需要篩選適宜的填充劑種類及其比例。首先,選取乳糖和糊精進(jìn)行復(fù)配作為填充劑使用,由表3可以看出,隨著乳糖比例的減少,即糊精比例的增加,咀嚼片的硬度逐漸提高,但是在乳糖和糊精比例達(dá)到1∶1時(shí),顆粒的休止角超過了30°,這說明乳糖的比例降低,所制得的顆粒流動(dòng)性較差,在加工過程中,出現(xiàn)粘沖的現(xiàn)象。這是因?yàn)楹[水提物本身有粘性,加上糊精的吸水性較好,在加工過程中,兩者粘合性過強(qiáng),導(dǎo)致片劑硬度過大,顆粒流動(dòng)性較差。為了改善加工過程中粘沖的現(xiàn)象,調(diào)整糊精的比例,引入MCC進(jìn)行3者復(fù)配。通過表3可以看出,由于糊精比例的下降,咀嚼片的硬度和顆粒的流動(dòng)性都有了改善,但是在加工過程中,仍然存在有粘沖的現(xiàn)象,因此舍棄糊精,僅使用乳糖和MCC復(fù)配作為填充劑。調(diào)整乳糖和MCC比例時(shí),咀嚼片的硬度為43.1~50.3 N,顆粒的休止角為30°以下,均在適宜的范圍,但是隨著乳糖比例的下降片劑的硬度有所提高,顆粒的流動(dòng)性有所下降,因此,選取乳糖和MCC比例為2∶1作為適宜的填充劑復(fù)配比例來使用。
表3 寒蔥咀嚼片填充劑種類和比例的篩選
2.2.2 寒蔥提取物添加量的選擇
寒蔥水提物為黃褐色粉末,有較強(qiáng)的寒蔥刺激性氣味,且粘度較大,因此,寒蔥提取物的添加量不宜過高。從表4中可以看出,隨著寒蔥提取物比例的升高,咀嚼片的硬度逐漸升高,在寒蔥提取物用量為20%時(shí),咀嚼片的硬度已經(jīng)超出了適宜的范圍,且出現(xiàn)了粘沖的現(xiàn)象。對咀嚼片進(jìn)行感官評價(jià)結(jié)果,寒蔥提取物添加量超過10%,其感官評分降低,因此,確定寒蔥提取物適宜的添加量為10%。
表4 寒蔥提取物添加量對咀嚼片品質(zhì)的影響
2.2.3 甘露醇添加量的篩選
從表5可以看出,隨著甘露醇添加量的增多,咀嚼片的硬度有所增加,但是都處于適宜的范圍中,但是感官品質(zhì)有差異。當(dāng)甘露醇添加量為4%時(shí),就達(dá)到了較好的矯味效果,感官評分達(dá)到最大值4.38,因此選取4%為甘露醇的適宜添加量。
通過試驗(yàn),確定利用寒蔥提取物制備咀嚼片的適宜配方為:寒蔥提取物10%,乳糖57.3%,MCC 28.7%,甘露醇4%。
表5 甘露醇添加量對寒蔥咀嚼片品質(zhì)的影響
2.2.4 寒蔥咀嚼片殺菌工藝的研究
該試驗(yàn)中選擇對壓片前的顆粒進(jìn)行殺菌處理,再對處理后的顆粒進(jìn)行壓片操作,最后對所制得的咀嚼片進(jìn)行微生物指標(biāo)的測定。從表6中可以看出,在微波單獨(dú)處理15 s的條件下,殺菌效果較差,使用紫外線長時(shí)間處理或者紫外線與微波復(fù)合處理,殺菌效果有了較大的提升,但是仍然沒有得到很好的效果,菌落總數(shù)超過《GB16740-2014保健食品》中的限量要求。采用紫外線輻照與臭氧熏制復(fù)合處理,在無菌和自然條件下壓片,菌落總數(shù)都<600 CFU/g,達(dá)到了理想的效果。在實(shí)驗(yàn)所得的咀嚼片中,均未檢出大腸菌群。
表6 殺菌方法對寒蔥咀嚼片殺菌效果的影響
2.2.5 寒蔥咀嚼片的質(zhì)量檢查
按照中國藥典的相關(guān)規(guī)定對咀嚼片進(jìn)行質(zhì)量和脆碎度的檢查,所制得咀嚼片的片重差異為1.7%,小于藥典規(guī)定的5.0%,檢驗(yàn)結(jié)果為合格。經(jīng)脆碎度測定處理后,咀嚼片失重為0.2%,小于藥典規(guī)定的1%,沒有檢出斷裂、龜裂及粉碎的片,不用進(jìn)行復(fù)檢,檢驗(yàn)結(jié)果為合格。
2.3.1 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟系數(shù)的影響
臟器重量的變化可作為粗略反映生物體器官是否正?;蛩ダ铣潭鹊闹笜?biāo),肝臟重量的降低會(huì)直接影響動(dòng)物的生長發(fā)育。由圖2可知,模型組小鼠的肝臟系數(shù)極顯著低于正常組,說明CCl4嚴(yán)重?fù)p傷了小鼠肝臟,但是經(jīng)過寒蔥咀嚼片灌胃處理的小鼠肝臟系數(shù)顯著高于模型組,且與陽性組無顯著差異。由此可以看出寒蔥咀嚼片對急性肝損傷小鼠的肝臟組織具有保護(hù)作用,并且其效果相當(dāng)于水飛薊素。
注:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
2.3.2 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響
轉(zhuǎn)氨酶是催化氨基酸與酮酸之間氨基轉(zhuǎn)移的一類酶,其中ALT和AST是最常見的兩種酶,而肝臟損傷往往表現(xiàn)為ALT和AST的活性異常[22],導(dǎo)致血清中的活性升高。寒蔥咀嚼片對小鼠血清中ALT和AST活性的影響如圖3所示。模型組小鼠血清中的ALT和AST活性顯著高于正常組,說明小鼠肝臟被CCl4損傷。而咀嚼片組血清中ALT和AST的活性顯著低于模型組,可得出寒蔥咀嚼片能夠有效抑制被CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT和AST活性。咀嚼片組小鼠血清中ALT的活性與陽性組無顯著性差異,AST活性也與陽性組無顯著差異,但略低于陽性組,證明寒蔥咀嚼片對被CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中ALT和AST活性的抑制效果相當(dāng)于水飛薊素處理的效果。
2.3.3 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織形態(tài)的影響
小鼠肝臟組織形態(tài)觀察結(jié)果如圖4所示,該結(jié)果顯示,正常組小鼠肝臟邊緣銳利、呈深紅色、表面有光澤、質(zhì)地柔軟、富有彈性。模型組的小鼠肝臟出現(xiàn)彌漫性腫大的現(xiàn)象,肝臟質(zhì)地較差,毫無彈性,表面粗糙,沒有光澤,肝臟表面可見乳白色顆粒狀物質(zhì),可能為壞死細(xì)胞。咀嚼片組與模型組相比,肝臟色澤變得更紅,質(zhì)地更加柔軟,富有彈性,表面光滑,肝臟表面未見乳白色顆粒。通過圖4-C、D可以看出,咀嚼片組小鼠的肝臟色澤、彈性、質(zhì)地略優(yōu)于陽性組,呈現(xiàn)出正常的暗紅色光澤,其狀態(tài)基本接近于正常組。
注:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
A:正常組;B:模型組;C:咀嚼片組;D:陽性組
2.3.4 寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響
小鼠肝臟經(jīng)過固定、石蠟切片、HE染色等操作,最終在100、200、400倍光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織病理學(xué)。由圖5可知,正常組中肝細(xì)胞界限明顯,中央靜脈周圍的細(xì)胞呈放射狀排列。而模型組中,肝細(xì)胞邊界不清晰,中央靜脈周圍的細(xì)胞排列紊亂,出現(xiàn)典型的細(xì)胞凝聚現(xiàn)象。但是咀嚼片組肝細(xì)胞界限比較明顯,中央靜脈周圍的細(xì)胞排列比較整齊,細(xì)胞凝聚現(xiàn)象得到明顯改善,咀嚼片組的肝臟組織與正常組接近,說明小鼠肝損傷進(jìn)程被寒蔥咀嚼片所控制。
A:正常組;B:模型組;C:咀嚼片組;D:陽性組
CCl4急性肝損傷模型是經(jīng)典的肝損傷模型,常被用來篩選具有肝保護(hù)作用的藥物[23]。CCl4進(jìn)入機(jī)體后,經(jīng)肝臟細(xì)胞色素 P450代謝產(chǎn)生三氯甲基自由基和過氧三氯甲基自由基,破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),造成肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷。脂質(zhì)過氧化損傷破壞肝細(xì)胞膜的完整性,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的AST和ALT釋放入血,因此血清AST和ALT活性水平被認(rèn)為是肝損傷最敏感的金指標(biāo),并被廣泛應(yīng)用于對急性肝損傷的診斷[24]。研究結(jié)果顯示,寒蔥咀嚼片灌胃劑量以3 g/kg·d連續(xù)灌胃30 d后,能顯著降低被CCl4誘導(dǎo)的小鼠血清中AST和ALT的活性,說明寒蔥咀嚼片能抑制細(xì)胞色素酶P450的活性,減少自由基的產(chǎn)生,減輕或阻斷由于過氧化而引起的肝細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞壞死,從而達(dá)到降低轉(zhuǎn)氨酶的效果。另外肝臟組織形態(tài)和病理學(xué)檢查結(jié)果顯示,寒蔥咀嚼片能夠顯著緩解肝細(xì)胞變性壞死等病理性改變,說明寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷具有顯著的保護(hù)作用。
寒蔥咀嚼片中主要活性物質(zhì)來源是寒蔥提取物,而蔥屬植物中大多含有豐富的黃酮類物質(zhì),而黃酮類物質(zhì)具有清肝、抗菌、治療急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化的作用。該實(shí)驗(yàn)中采用HPLC法對寒蔥提取物中蘆丁、槲皮素和山奈酚進(jìn)行了分析,結(jié)果表明寒蔥提取物中蘆丁含量最高,其次為山奈酚,槲皮素含量最低。通過研究表明,蘆丁、槲皮素和山奈酚對肝損傷小鼠具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能是黃酮類物質(zhì)減少自由基的生成[25-27]。因此,寒蔥咀嚼片對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用,可能主要來源于咀嚼片中的蘆丁等黃酮類物質(zhì)。
以寒蔥提取物為原料,通過濕法制粒法制備寒蔥咀嚼片,其最佳制備工藝配方為:寒蔥提取物10%,乳糖57.3%,MCC 28.7%,甘露醇4%;殺菌條件為:壓片前對顆粒進(jìn)行紫外線照射和臭氧處理各4 h。通過對小鼠的肝臟系數(shù)、血清中轉(zhuǎn)氨酶活性、肝臟組織形態(tài)和病理學(xué)的觀察,可以確認(rèn)寒蔥咀嚼片對CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有很好的保護(hù)作用,有望開發(fā)成具有肝保護(hù)作用的保健產(chǎn)品。