朱純宇， 尹 月， 李鐘淑， 方南洙

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是體外生產(chǎn)胚胎的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，已廣泛用于哺乳動(dòng)物胚胎的體外培養(yǎng)，在人工輔助生殖技術(shù)及胚胎工程中起著不可替代的作用[1]。然而，體外生產(chǎn)胚胎存在很強(qiáng)的困難性和復(fù)雜性，其原因是卵母細(xì)胞在體外沒(méi)有完全成熟。為提高體外胚胎生產(chǎn)的質(zhì)量，目前主要的方法是在體外培養(yǎng)液中加入抗氧化劑來(lái)改善和優(yōu)化體外培養(yǎng)體系，旨在將卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)(IVM)和體外受精(IVF)技術(shù)科學(xué)、有效、系統(tǒng)地建立起來(lái)，目前IVM和IVF技術(shù)生產(chǎn)出的體外胚胎仍然存在胚胎率低、質(zhì)量差的缺點(diǎn)[2]。

ROS是有氧代謝的副產(chǎn)物，當(dāng)ROS過(guò)量生成時(shí)會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[3]，ROS引起的氧化應(yīng)激是胚胎體外培養(yǎng)過(guò)程中卵母細(xì)胞成熟抑制和胚胎凋亡的重要原因[4]。有研究表明，氧化應(yīng)激與胚胎質(zhì)量之間有著密不可分的關(guān)聯(lián)性[5]，對(duì)哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)生影響的主要因素就是ROS[6]。研究表明在線粒體中可以產(chǎn)生ROS，線粒體還參與氧化應(yīng)激導(dǎo)致的胚胎凋亡過(guò)程，并調(diào)節(jié)胚胎氧化應(yīng)激[7]。ROS生成量取決于線粒體的代謝平衡，當(dāng)線粒體的功能發(fā)生異常和突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致三羧酸循環(huán)或電子傳遞鏈的功能障礙，從而產(chǎn)生過(guò)量的ROS。有研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化劑能夠阻止過(guò)量ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，或者能夠直接清除過(guò)量的ROS[8]，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原體系的動(dòng)態(tài)平衡，保護(hù)細(xì)胞和內(nèi)環(huán)境免受破壞[9]。此外，抗氧化劑在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子抗氧化過(guò)程中的發(fā)揮著不可忽視的作用[10]。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，胚胎容易受到氧化應(yīng)激，從而影響其生長(zhǎng)發(fā)育[11-12]，因此，保護(hù)胚胎免受氧化應(yīng)激，對(duì)于提高體外胚胎生產(chǎn)質(zhì)量至關(guān)重要[13]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將某些適宜濃度的抗氧化劑添加到體外培養(yǎng)液中，能夠使胚胎內(nèi)ROS水平大幅度降低[14-15]。

甘草素是一種黃酮類(lèi)化合物，常見(jiàn)于蔬菜、堅(jiān)果、水果、草藥中[16]，具有多種生化和藥理特性，包括抗高脂血癥、抗炎、抗過(guò)敏[17-20]。研究表明，LQ可以降低哺乳動(dòng)物生殖細(xì)胞的凋亡率[21-23]，同時(shí)也有研究證實(shí)LQ對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[24]，對(duì)ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用[25]。LQ被認(rèn)為是一種有效的ROS清除劑，可以有效地防止ROS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。LQ的抗氧化活性來(lái)源于酚羥基，與氫發(fā)生反應(yīng)，氫原子被轉(zhuǎn)移并與活性氧結(jié)合以終止ROS介導(dǎo)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而阻止自由基的產(chǎn)生[26]。

雖然甘草素應(yīng)用廣泛，但在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中，特別是在雌性配子和早期胚胎發(fā)育過(guò)程中的具體作用機(jī)制尚不清楚。該試驗(yàn)通過(guò)將適宜濃度的甘草素添加到體外培養(yǎng)基中，探討甘草素對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響，旨在為甘草素進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

該試驗(yàn)使用的小鼠購(gòu)自延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(SYXK2020-0009)，品種為昆明系小白鼠。其中，雌性小白鼠7周齡，體重30 g以上；雄性小白鼠8周齡以上，活潑健康，單籠飼養(yǎng)，種用壽命為半年；雌雄小鼠均達(dá)到性成熟。

1.2 主要試劑

甘草素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；KSOM培養(yǎng)液、M2培養(yǎng)液均購(gòu)自南京愛(ài)貝生物公司；透明質(zhì)酸酶(Hy)、二甲基亞砜(DMSO)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)均購(gòu)自Sigma公司；ROS(DCFH-DA)熒光染色劑、GSH(CMF2HC)熒光染色劑和線粒體JC-1熒光染色劑均購(gòu)自Thermo Fisher公司；孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)均購(gòu)自寧波第二激素廠。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 胚胎的收集

小鼠第1天下午17:00進(jìn)行PMSG(10 IU)腹腔注射，每只小鼠0.1 mL PMSG。第3天下午17:00對(duì)同一批雌鼠于進(jìn)行hCG(10 IU)腹腔注射，每只小鼠0.1 mL hCG。注射 hCG 后立即與成年公鼠進(jìn)行1∶1合籠交配，在合籠22 h后用頸椎脫臼法處死雌鼠，無(wú)菌手術(shù)摘取輸卵管膨大部，然后將其放入已經(jīng)預(yù)平衡的M2培養(yǎng)液中。在體視顯微鏡下劃破輸卵管膨大部，收集卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物，將其移入含有0.1% Hy的KSOM小滴中處理2 min，同時(shí)輕輕吹打幾次，以去除顆粒細(xì)胞，將揀出的合子在KSOM培養(yǎng)液中洗滌5次，然后收集合子。

1.3.2 胚胎的體外培養(yǎng)

將收集的合子放入已經(jīng)預(yù)平衡的KSOM培養(yǎng)基中,對(duì)照組用KSOM清洗3次，5個(gè)試驗(yàn)組分別用含有0、10、20、30、40、50 μmol/L甘草素的KSOM清洗3次，然后置于預(yù)平衡的培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚，通過(guò)劑量反應(yīng)研究，囊胚率最高的LQ濃度為該試驗(yàn)的最適濃度。

1.3.3 胚胎內(nèi)ROS水平的檢測(cè)

取不同處理組發(fā)育狀態(tài)良好的胚胎，用移液槍吸取適量PVA洗液，制作3個(gè)微滴，依次洗滌；用撿卵針將洗滌好的胚胎轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的DCFH-DA染色液微滴中，5% CO2、37 ℃條件下孵育20 min；孵育后的囊胚經(jīng)PVA洗液洗滌3次后，再用KSOM培養(yǎng)液洗滌3次，然后將洗過(guò)的的囊胚分別單獨(dú)放在KSOM微滴中，最后移至熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。

1.3.4 胚胎內(nèi)GSH水平的檢測(cè)

取不同處理組發(fā)育狀態(tài)良好的胚胎，用移液槍吸取適量PVA洗液，制作3個(gè)微滴，依次洗滌；用撿卵針將洗滌后的胚胎轉(zhuǎn)移至事先準(zhǔn)備好的CMF2HC染色液微滴中，5% CO2、37 ℃條件下孵育20 min；孵育后的囊胚經(jīng)PVA洗液洗滌3次后，再用KSOM培養(yǎng)液洗滌3次，然后將洗過(guò)的的囊胚分別單獨(dú)放在KSOM微滴中，最后移至熒光顯微鏡下觀察并照相記錄。

1.3.5 胚胎線粒體膜電位的檢測(cè)

取不同處理組發(fā)育狀態(tài)良好的胚胎，放置于含有10 μg/mL JC-1的IVC培養(yǎng)液中，5% CO2、37 ℃條件下孵育20 min；染色后的囊胚期胚胎在PBS-PVA 中洗滌3～5次，放置在含有10 μL 的PBS的載玻片上；在熒光顯微鏡下分別利用紅色熒光和綠色熒光濾鏡觀察并照相記錄。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)使用 SPSS(17.0版)進(jìn)行單因素方差分析，均為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”的形式。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著，P> 0.05 表示差異不顯著，每組數(shù)據(jù)至少重復(fù) 3 次。ROS、GSH、JC1染色圖片用Image J軟件進(jìn)行分析量化，其結(jié)果用相對(duì)平均熒光強(qiáng)度表示，然后對(duì)3次重復(fù)數(shù)據(jù)采用 SPSS 軟件分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度LQ對(duì)小鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響

該試驗(yàn)用濃度為0、10、20、30、40、50 μmol/L的甘草素(LQ)處理小鼠早期胚胎，體外培養(yǎng)至2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚階段，觀察并記錄各試驗(yàn)組不同時(shí)期胚胎的發(fā)育率(表1)。

表1 不同濃度甘草素處理體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎的發(fā)育率

6個(gè)不同濃度LQ處理組，比較2-細(xì)胞發(fā)育率時(shí)，0～40 μmol/L的LQ處理組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但50 μmol/L的LQ處理組2-細(xì)胞發(fā)育率顯著降低(P<0.05)；比較4-細(xì)胞發(fā)育率時(shí)，20 μmol/L的LQ處理組4-細(xì)胞發(fā)育率顯著高于0、10和30 μmol/L的LQ處理組(P<0.05)，且極顯著高于40、50 μmol/L的LQ處理組(P<0.01)，0、10和30 μmol/L的LQ處理組之間4-細(xì)胞發(fā)育率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于40、50 μmol/L的LQ處理組(P<0.05)，40和50 μmol/L的LQ處理組之間4-細(xì)胞發(fā)育率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；比較囊胚發(fā)育率時(shí)，20 μmol/L的LQ處理組囊胚發(fā)育率顯著高于0和10 μmol/L的LQ處理組(P<0.05)，且極顯著高于30、40和50 μmol/L的LQ處理組(P<0.01)，0和10 μmol/L的LQ處理組之間囊胚發(fā)育率無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于30、40和50 μmol/L的LQ處理組(P<0.05)，30、40和50 μmol/L的LQ處理組之間囊胚發(fā)育率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。為了更直觀性、形象性地表示不同濃度的LQ處理對(duì) IVC 昆明小白鼠早期胚胎體外發(fā)育的影響，將表1整理匯成折線圖(圖1)。

從圖1可以清晰地看出，不同濃度LQ處理組的2-細(xì)胞發(fā)育率、 4-細(xì)胞發(fā)育率和囊胚發(fā)育率變化趨勢(shì)均呈山峰形，且20 μmol/L LQ處理組的2-細(xì)胞發(fā)育率、 4-細(xì)胞發(fā)育率和囊胚發(fā)育率均處于峰值狀態(tài)，該本試驗(yàn)最終采用 LQ的濃度為20 μmol/L，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 不同濃度甘草素處理體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎發(fā)育率的變化趨勢(shì)圖

2.2 LQ對(duì)早期胚胎ROS水平的影響

由于ROS的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而使胚胎凋亡，所以ROS水平對(duì)體外培養(yǎng)胚胎至關(guān)重要。為檢測(cè)LQ在早期胚胎中的抗氧化作用，檢測(cè)對(duì)照組和甘草素處理組的ROS水平(圖2)。對(duì)該結(jié)果進(jìn)行量化分析，試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組ROS水平顯著高于甘草素處理組(P<0.05)。表明LQ可以降低小鼠胚胎內(nèi)部的ROS水平，減少氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷。

A.對(duì)照組；B.甘草素處理組

2.3 LQ對(duì)早期胚胎GSH水平的影響

在哺乳動(dòng)物胚胎中，GSH作為清除因子可以降低氧化應(yīng)激帶來(lái)的損傷，同時(shí)也是影響胚胎質(zhì)量的重要因素。為檢測(cè)LQ對(duì)早期胚胎質(zhì)量的影響,檢測(cè)對(duì)照組和甘草素處理組中的GSH水平(圖3)。對(duì)該結(jié)果進(jìn)行量化分析，結(jié)果表明甘草素處理組GSH水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。表明LQ可以提高小鼠胚胎內(nèi)部的GSH水平，促進(jìn)小鼠胚胎的后續(xù)發(fā)育。

A.對(duì)照組；B.甘草素處理組

2.4 LQ對(duì)早期胚胎中線粒體膜電位的影響

采用JC1熒光染色法檢測(cè)早期胚胎中的線粒體膜電位的變化，線粒體膜電位通過(guò)紅色與綠色熒光的比值得到，紅色熒光較強(qiáng)表明胚胎線粒體膜電位較強(qiáng)，綠色熒光較強(qiáng)表明線粒體膜電位較弱(圖4)。對(duì)該結(jié)果進(jìn)行量化分析，試驗(yàn)結(jié)果顯示甘草素處理組的紅綠熒光強(qiáng)度比率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。表明LQ可以提高小鼠胚胎線粒體膜電位極性，保護(hù)小鼠胚胎免受氧化應(yīng)激所致的凋亡。

A.對(duì)照組；B.甘草素處理組

3 討論與結(jié)論

LQ是天然的抗氧化劑，通過(guò)添加LQ可以緩解小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。在該試驗(yàn)中，當(dāng)LQ濃度為20 μmol/L 時(shí)，小鼠囊胚率最高，且在折線圖中處于峰值狀態(tài)，但是當(dāng)LQ濃度為30 μmol/L 時(shí)，囊胚率反而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是過(guò)高濃度的LQ本身會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生不利影響；另一方面，也可能是出現(xiàn)ROS過(guò)量清除現(xiàn)象，很大程度上破壞ROS動(dòng)態(tài)平衡機(jī)制，可能還會(huì)將許多不良影響傳遞給胚胎。通過(guò)后者可以得出，在胚胎正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，ROS也起到一定作用，過(guò)量的清除ROS也會(huì)對(duì)胚胎產(chǎn)生不利影響，這與 Rajasekaran NS等[27]人的研究一致。

如果ROS過(guò)量增加，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，同時(shí)ROS會(huì)對(duì)DNA以及脂質(zhì)等重要分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞[28]。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS超過(guò)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)時(shí)，可能會(huì)引發(fā)細(xì)胞凋亡和損傷。為證實(shí)LQ通過(guò)清除過(guò)量的ROS提高胚胎的質(zhì)量，該試驗(yàn)選用能夠與ROS反應(yīng)產(chǎn)生特定熒光信號(hào)的染料DCFHDA進(jìn)行染色標(biāo)記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草素處理組的ROS水平顯著低于對(duì)照組，因此認(rèn)為L(zhǎng)Q可以清除胚胎發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生過(guò)量的ROS，同時(shí)減輕胚胎內(nèi)部的氧化損傷，這與Huang等[29]人的研究結(jié)果一致。

還原型谷胱甘肽(GSH)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物[30]，具有普遍性和低分子量的特點(diǎn)，同時(shí)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡相關(guān)通路[31]。在體外培養(yǎng)胚胎過(guò)程中，哺乳動(dòng)物胚胎對(duì)ROS水平的變化非常敏感，其中，GSH水平是影響胚胎質(zhì)量的重要因素[32]。Ozawa M等[33]人的研究證實(shí)，在嚙齒類(lèi)動(dòng)物和豬胚胎中GSH具有清除ROS的作用，并且胚胎內(nèi)GSH水平與胚胎發(fā)育和細(xì)胞增殖等過(guò)程有著密不可分的關(guān)聯(lián)性。該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，甘草素處理組的GSH水平顯著高于對(duì)照組,因此，LQ可以提高GSH水平，對(duì)減少胚胎自身產(chǎn)生氧化應(yīng)激具有緩解作用。

線粒體是卵母細(xì)胞發(fā)育所需的主要細(xì)胞器，其完整性是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的關(guān)鍵指標(biāo)之一[34]。在胚胎早期發(fā)育的過(guò)程中，線粒體起著至關(guān)重要的作用，線粒體功能異?？梢灾苯佑绊懺缙谂咛サ陌l(fā)育，導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯和胚胎凋亡。該試驗(yàn)中對(duì)照組紅綠熒光比率明顯低于甘草素處理組，此結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)過(guò)程中加入LQ可顯著增強(qiáng)線粒體膜電位,同時(shí)緩解氧化應(yīng)激引起的線粒體膜電位降低，進(jìn)而真正意義上促進(jìn)早期胚胎的發(fā)育。

通過(guò)對(duì)上述試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析探討，可以發(fā)現(xiàn)將適宜濃度的LQ添加到小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)基中，可以提高囊胚率，降低胚胎內(nèi)ROS水平，提高GSH水平，改善早期胚胎線粒體功能，從而提高小鼠早期胚胎的發(fā)育能力。