雷學俊，楊康卓，張建敏，張霞，羅青春，喬宗偉，趙東，鄭佳

(宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓,644007)

“千年老窖萬年糟，酒好還需窖池老”的傳統(tǒng)經(jīng)驗提示了窖池和糟醅在濃香型白酒釀造中的重要作用，因而科學地揭示糟醅與原酒質(zhì)量的關(guān)系無疑對提高原酒質(zhì)量具有重要指導意義。濃香型白酒釀造的核心過程是糧谷類原料經(jīng)蒸煮后，在密閉的泥窖中經(jīng)大曲、窖泥中復雜微生物菌群的代謝作用，產(chǎn)生了紛繁復雜的風味物質(zhì)。多糧濃香型白酒由于采用多種糧食配方、續(xù)糟配料等工藝，糟醅經(jīng)長期的循環(huán)發(fā)酵，積累了大量的風味成分以及釀酒原料分解殘存物、微生物菌體自溶物及代謝產(chǎn)物等風味前體物質(zhì)，這些物質(zhì)對白酒酒體具有重要的貢獻作用[1]。曾有學者提出窖池內(nèi)涉及到復雜的物質(zhì)能量代謝過程[2]，但迄今為止并沒有更為深入的關(guān)于窖池內(nèi)物質(zhì)或能量的空間分布及交換規(guī)律的研究報道。

糟醅香氣成分的研究中，宮俐莉等[3]利用溶劑輔助風味蒸發(fā)法(sol ent assisted fla or e aporation,SAFE)和頂空固相微萃取(head space solid-phase microextraction,HS-SPME)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)鑒定出酒醅中揮發(fā)性風味成分120種，其中酯類66種、醇類13種、醛酮類9種、醚酚類6種以及縮醛類、脂肪酸、醚酚類、烯烴類等。郭家秀等[4]確定蒸餾-微溶劑萃取法是一種適宜萃取糟醅中低沸點成分的方法?；诟咝б合嗌V法分析了濃香型白酒發(fā)酵過程中香氣成分動態(tài)變化,研究發(fā)現(xiàn),乙酸、丁酸、己酸和乳酸的變化趨勢與對應的乙酯生成趨勢大體一致[5]。孫金沅等[6]利用SAFE結(jié)合GC-MS分析比較了入池和出池糟醅的39種揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)下層糟醅中的含量最高。趙東等[7]利用HS-SPME/GC-MS研究了不同空間層次的五糧液出窖糟醅和窖泥的香氣成分，發(fā)現(xiàn)窖邊糟中香氣成分的含量顯著高于中心糟。然而，對糟醅中風味成分在不同空間的分布情況并沒有開展深入的研究。

本研究利用HS-SPME/GC-MS檢測了不同層次糟醅不同空間位置的香氣成分，系統(tǒng)討論了多糧濃香型糟醅中香氣成分的空間分布規(guī)律，為探討糟醅對酒質(zhì)的影響提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品采集

所有糟醅樣品均采自宜賓五糧液股份有限公司2個釀酒車間各一口窖池，窖齡分別為30年和15年(編號分別為A和B)。

糟醅采集方法:如圖1所示，將窖池中糟醅垂直中線分為3層，分別表示上層(距地面約20 cm)、中層(距黃水線上約20 cm)、下層(黃水線下10 cm)糟醅。如圖1黑點所示，每層糟醅按距離窖壁0(邊糟)、10、20、50、100 cm(中心糟)等5個點取樣，每點采集3個平行樣品，分別取500 g，混合均勻，密封袋包裝，置于-20 ℃保藏待測。

圖1 糟醅取樣的位置Fig.1 Sampling positions of fermented grains

1.1.2 試劑和儀器

C7-C30直鏈正構(gòu)烷烴,美國Sigma-Aldrich公司，為GC純；攪拌機，Philips公司；頂空固相微萃取手柄、50/30 μm CAR/D B/PDMS Stableflex纖維萃取頭(1 cm)，美國Supelco公司；PAL RTC2-7890B-5977B MSD帶有全自動樣品前處理平臺的氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司；DB-WAX石英毛細管色譜柱(30.0 m×0.25 mm ×0.25 μm)，J&W scientific，美國Agilent公司。

1.1.3 樣品前處理

取100 g，-20 ℃完全冷凍樣品于攪拌機中，攪拌均勻，待用。

1.2 HS-SPME條件

稱取1.00 g處理好的樣品于20 mL頂空樣品瓶中，加入定量內(nèi)標(4-辛醇，5.5 mg)，置于50 ℃金屬浴中平衡15 min，插入萃取頭吸附45 min，隨后插入GC進樣口熱解析3 min，分析其中香氣成分[1]。每個樣品2個平行測試。

1.3 GC-MS條件

GC條件：進樣口溫度250 ℃，載氣(He)流速1.0 mL/min，不分流模式進樣。升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

MS條件：質(zhì)譜EI源，電子轟擊能量70 e ；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z35～350。

1.4 香氣成分的定性與定量方法

香氣成分的定性方法[9]：先將化合物與NIST14標準數(shù)據(jù)庫(美國Agilent公司化學工作站內(nèi)置)進行比對，匹配度>800(最大值1 000)作為初步定性結(jié)果；再計算各物質(zhì)的Ko ats保留指數(shù)(retention index,RI)[10]，并與文獻報道的RI值進行比較。同時，與標準品在相同色譜條件下的保留時間對比，最終確定該物質(zhì)的歸屬。

香氣成分的定量采用內(nèi)標法測定，參考內(nèi)標質(zhì)量濃度，以待測成分與內(nèi)標的峰面積之比計算待測成分的半定量信息，單位以μg/g表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prism8和R語言工具進行不同窖池不同層次糟醅的數(shù)據(jù)分析，其中R語言進行熱圖繪制過程中按行進行均一化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 糟醅香氣成分的空間分布規(guī)律

由圖2可知，糟醅香氣成分的總含量分布規(guī)律為下層>中層≥上層。上層和中層糟醅的香氣成分平均含量分別為2 053.4和2 927.4 μg/g，而下層糟醅香氣成分的平均含量是上層和中層的3～4倍，達到8 605.9 μg/g。這可能是由于糟醅發(fā)酵過程中產(chǎn)生的黃水[11]在重力作用下自然下滲并富集于窖池底部，使得下層糟醅中香氣物質(zhì)的含量較高。

同一口窖池中，不同層次窖邊糟(0 cm)中各類香氣含量均顯著高于中心糟(100 cm)，這與先前的研究結(jié)果一致[6]。同時，糟醅中主要的2類香氣成分—酯類和酸類，含量范圍分別為：192.63～2 792.91 μg/g(占76%左右)和32.38～899.57 μg/g (占18%左右)，同時，這2類成分的含量在同層的分布規(guī)律為距離窖泥越近含量越高(0 cm>10 cm>20 cm>50 cm>100 cm)，這可能是由于在濃香型白酒發(fā)酵過程中，窖邊糟的營養(yǎng)成分、香氣及前體物質(zhì)主要來自于與之長期接觸的窖泥，進而與中心糟醅形成鮮明對比。此外，醇類、芳香族、醛酮類成分的總含量并未呈現(xiàn)顯著的空間異質(zhì)性。

a-窖池A; b-窖池B圖2 糟醅香氣成分含量的空間分布規(guī)律Fig.2 Spatial ariation of olatile compounds in fermented grains

2.2 主要香氣成分的空間分布規(guī)律

2.2.1 酸類成分

酸類化合物除本身可作為酒體風味物質(zhì)外，還是白酒中酯類生物合成的重要前體物質(zhì)[12-13]。如圖3所示，本研究中共檢出9種酸類成分，占糟醅香氣成分總含量的18.26%，其中己酸(58.31%)、乙酸(29.89%)、丁酸(8.41%)、戊酸(5.33%)、庚酸(1.12%)、3-甲基丁酸(1.05%)是糟醅中的優(yōu)勢成分，占酸類成分含量的99.60%。乳酸不具有揮發(fā)性，故未檢出。而檢出的有機酸均屬于窖泥中的優(yōu)勢成分[1]。

各優(yōu)勢酸類成分含量的分布規(guī)律為下層>中層>上層，且同層糟醅中距離窖泥越近含量越高，這與YAN等[14]的研究結(jié)果一致。值得注意的是，窖泥中的主要有機酸[1]，包括己酸、丁酸、戊酸和辛酸在下層糟醅中具有明顯的擴散遞減現(xiàn)象(0 cm>10 cm=20 cm>50 cm>100 cm)，推測原因是：一方面它們主要是由窖泥中梭菌屬[15]細菌代謝產(chǎn)生，另一方面下層酒醅在發(fā)酵過程中由于原料水解和微生物的代謝生長活動使水分含量較高而呈現(xiàn)半固態(tài)，窖泥中的梭菌屬等微生物可以通過遷移或擴散進入酒醅[16]，但由于從窖泥遷移至酒醅中的微生物并非是同比例增加的，故造成其代謝產(chǎn)物的含量有明顯擴散遞減現(xiàn)象。此外，中、上層中的乙酸含量高于下層。

a-窖池A; b-窖池B、S-上層、Z-中層、X-下層圖3 酸類成分的變化情況Fig.3 Spatial ariation of acids in ferment grains

2.2.2 酯類成分

酯類成分是濃香型白酒固態(tài)發(fā)酵酒醅中最重要的微量香味成分[17]。本研究中共檢出49種酯類成分，占糟醅香氣成分總含量的75.97%，其中己酸乙酯(54.48%)、乳酸乙酯(14.78%)、乙酸乙酯(12.25%)、戊酸乙酯(3.79%)、庚酸乙酯(4.70%)、丁酸乙酯(2.45%)、辛酸乙酯(1.74%)、己酸己酯(1.00%)是糟醅中的優(yōu)勢酯類成分，占酯類成分含量的95.19%。四大酯類和其他酯類的變化情況如圖4和圖5所示，四大酯占總酯類的83.96%，其中己酸乙酯占比量高，占四大酯類總含量的64.89%，這與孫金沅等[18]的研究結(jié)果一致；乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯與己酸乙酯之比分別為0.27∶1、0.04∶1、0.22∶1，符合優(yōu)質(zhì)白酒要求的比例范圍[19]。

糟醅中(圖4)的己酸乙酯和丁酸乙酯含量的分布規(guī)律為下層>中層>上層，且同層糟醅中距離窖泥越近含量越高；上層和中層糟醅以乙酸乙酯或丁酸乙酯、乳酸乙酯為主，而下層糟醅中則是以己酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸乙酯為主。

a-窖池A; b-窖池B、S-上層、Z-中層、X-下層圖4 四大酯類成分的變化情況Fig.4 Spatial ariation of four esters in ferment grains

a-窖池A; b-窖池B;S-上層、Z-中層、X-下層圖5 其他酯類成分的變化情況Fig.5 Spatial ariation of other esters in ferment grains

由圖5可知，其他酯類成分含量的分布規(guī)律：下層≥中層>上層，同層糟醅中0 cm(窖邊糟)處的其他酯類成分含量顯著高于同層中的其他位點，且下層中有明顯的擴散降低現(xiàn)象(0 cm>10 cm/20 cm>50 cm≥100 cm)，可能的原因是：一方面由于窖底泥中的酯化酶活力高和厭氧功能菌代謝更旺盛，導致窖底泥產(chǎn)生積累的酯類等代謝產(chǎn)物持續(xù)進入糟醅中，使窖池下層糟醅酯含量高；另一方面如前文所述的黃水下滲積累所致[20]。己酸己酯、己酸丁酯是窖壁窖泥中的主要特征成分[21]，其在糟醅中的變化趨勢為下層>中層>上層，且在0 cm處含量最高(分別為20～77和2～50 μg/g)，其他位點存在少量(分別為0.1～15和0.02～9 μg/g)。這可能由于己酸己酯和己酸丁酯的前體成分—己酸含量較高的原因(圖3)。

2.2.3 醇類成分

醇類物質(zhì)是由葡萄糖和氨基酸降解產(chǎn)生，是酯類的前驅(qū)物質(zhì)[22]。如圖6所示，本研究共檢出9種醇類成分(占2.19%)，正己醇是除乙醇外含量最高的成分，具有割青草氣味[23]和甜味，是濃香型白酒的重要醇類物質(zhì)，在糟醅不同空間位置中分布規(guī)律為在0 cm處含量最高，同層其他位點含量較低且差異不明顯。值得注意的是窖池B下層中各醇類成分在0和20 cm處較高，具體原因還需進一步明確。

2.2.4 芳香族成分

芳香族成分經(jīng)酵母、細菌發(fā)酵生成，賦予了酒體優(yōu)雅醇厚的風味特征[24]，白酒中芳香族成分包括苯乙酸乙酯、對甲酚、苯酚等[25]。如圖7所示，本研究共檢出11種芳香族化合物(占3.20%)，苯乙酸乙酯(典型蜂蜜香)、對苯酚(煙熏味、苯酚味、馬廄味等復合氣味)、苯酚在糟醅不同空間位置的分布規(guī)律為下層>中層>上層，且在同層中0 cm處含量最高。值得注意的是，窖泥中梭狀芽孢桿菌的特征產(chǎn)物—對甲酚和苯酚在下層窖泥中的含量最高，且同層糟醅中0 cm處的含量最高,并且呈隨與窖泥的距離增加而減少的趨勢，可能是由于距離窖泥位置的不同，其微生物代謝作用不同所致。

a-窖池A; b-窖池B；S-上層、Z-中層、X-下層圖6 醇類成分的變化情況Fig.6 Spatial ariation of the alcohols

a-窖池A; b-窖池B；S-上層、Z-中層、X-下層圖7 芳香族類成分的變化情況Fig.7 Spatial ariation of the aromatic compounds

2.2.5 醛酮類成分

醛酮類化合物對濃香型酒的香氣起到一定的作用，其含量過高容易造成酒體呈苦味[26]。如圖8所示，本研究共檢出4種醛酮類(占0.38%)，醛酮類化合物在糟醅不同空間位置的含量較低，且無顯著的增減規(guī)律性。

a-窖池A; b-窖池B;S-上層、Z-中層、X-下層圖8 醛酮類類成分的變化情況Fig.8 Spatial ariation of the aldehydes and ketones

3 結(jié)論

續(xù)糟泥窖發(fā)酵是濃香型白酒區(qū)別于其他香型白酒的本質(zhì)特征之一，窖池內(nèi)微生物體系的構(gòu)成主要包括大曲投料、環(huán)境空氣中富集以及窖泥中棲息的原位微生物，通過直接或間接利用糟醅中的營養(yǎng)物質(zhì)以及代謝前體物質(zhì)，在糟醅自身、糟醅與窖泥接觸的界面乃至窖泥中產(chǎn)生紛繁復雜的風味成分。本研究系統(tǒng)分析了糟醅中主要香氣成分的空間分布規(guī)律，結(jié)果表明，在黃水下滲以及糟醅與窖泥的相互接觸下，各類糟醅香氣成分的空間分布規(guī)律為下層>中層>上層；再次確認了同層次窖邊糟中香氣成分的含量高于其他位點，其中的優(yōu)勢組分(己酸、丁酸、己酸乙酯、丁酸乙酯等)呈現(xiàn)顯著的擴散遞減趨勢；醇類、芳香族類、醛酮類成分的總含量并未呈現(xiàn)顯著的空間異質(zhì)性，但部分與窖泥風味顯著相關(guān)的物質(zhì)具有顯著的空間分布規(guī)律。本研究揭示了多糧濃香型白酒糟醅中香氣成分的空間分布規(guī)律，對全面認識糟醅在釀酒中對原酒風味的影響程度具有一定的借鑒意義。