王柯涵 向歡 楊懿德 張永輝 曾淑華 楊民烽 郭仕平 劉雷

摘要：為建立利用紫外分光光度法測定烤煙揮發(fā)油溶液濃度方法，先用同時(shí)蒸餾萃取方法得到烤煙揮發(fā)油，再用二氯甲烷將其稀釋成梯度溶液，紫外分光光度掃描，并確定工作波長，以此建立烤煙揮發(fā)油濃度與其紫外吸光度間的線性回歸方程。結(jié)果表明，烤煙揮發(fā)油的紫外光吸收帶在225～245 nm，239 nm最適合作為測定烤煙葉揮發(fā)油溶液濃度的工作波長，線性回歸方程為y = 0.250 1 x + 0.039 3，R2=0.999 3，且有很好吸光度重復(fù)性（RSD<0.5%）;所得線性工作曲線的LOD為0.153 g/L，LOQ為0.464 g/L。

關(guān)鍵詞：烤煙;揮發(fā)油;紫外光;分光光度法;定量

中圖分類號：O69;S572? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）18-0116-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.023

Determination of the concentration of flue-cured tobacco

volatile oils by UV-spectrophotography

WANG Ke-han1，2，XIANG Huan1，3，YANG Yi-de4， ZHANG Yong-hui5，

ZENG Shu-hua1，YANG Min-feng6，GUO Shi-ping6，LIU Lei1

（1. Agricultural College of Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China; 2.Shifang？Bureau？of？Development Reform and Sci-tech， Deyang 618400， Sichuan， China; 3.Sichuan Tobacco Corporation Deyang Branch， Deyang? 618400， Sichuan， China; 4. Sichuan Tobacco Corporation Yibin Branch， Yibin? 644000， Sichuan， China; 5.Sichuan Tobacco Corporation Luzhou? Branch， Luzhou? 646000， Sichuan， China; 6.Sichuan Provincial Tobacco Company， Chengdu? 610041， China）

Abstract： To determining the concentration of volatile oils solution extracted from flue-cured tobacco leaves， a method based on UV spectrophotometry was researched. Volatile oils were extracted by simultaneous distillation and diluted with dicholormethane to prepare a set of gradient solutions. Each solution was scanned by UV spectrophotomet. The best working wavelength was selected to establish linear regression equation between the concentration of volatile oil and its ultraviolet absorbance. Results showed that the volatile oils had a large absorption spectrum between 225～245 nm. The best analysis wavelength was 239 nm， the linear relationship was? ? ? y =0.250 1x + 0.039 3， R2=0.999 3. Its relative error of was less than 0.5%， the limit of detection （LOD） and the limit of quantification （LOQ） of the working curve were 0.153 g/L and 0.464 g/L separately.

Key words： flue-cured tobacco; volatile oils; ultraviolet light; spectrophotography; determination

煙葉油分是指煙葉組織細(xì)胞內(nèi)含有的柔軟半液體或液體物質(zhì)，在煙葉外觀上反映為油潤、豐滿、枯燥的程度。油分是煙葉分級工作中重要的分級因素，也是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)[1，2]?？緹熡头质且粋€(gè)概括性極強(qiáng)的品質(zhì)因素，其中涉及的化學(xué)成分極為復(fù)雜，主要可分為揮發(fā)油組分和非揮發(fā)油組分。煙草非揮發(fā)油組分中主要有油脂、樹脂、蠟質(zhì)、類脂物、甾醇以及色素等;而揮發(fā)油（Volatile oils）則是一類具有揮發(fā)性的芳香氣味油狀物質(zhì)的總稱。煙葉揮發(fā)油主要包括低分子的烴類、酚類、醇類、醚類、酮類、醛類、酸類、酯類等，能隨水蒸氣蒸餾而不被破壞，在常溫下即可散發(fā)出芳香氣味[3];是體現(xiàn)煙葉優(yōu)良商品特性的重要物質(zhì)，影響著煙葉的外觀品質(zhì)、感官品質(zhì)和物理特性[4]。

目前，關(guān)于烤煙揮發(fā)油的研究主要關(guān)于提取方法和某些具體物質(zhì)成分的定性分析、定量分析[5，6]。將烤煙揮發(fā)油作為一個(gè)整體來研究其含量測定的方法尚屬少見[7]。應(yīng)用較多的揮發(fā)油定量分析方法是稱重法，即將經(jīng)蒸餾萃取得到的揮發(fā)油進(jìn)行除水干燥和有機(jī)溶劑揮發(fā)后稱重求出其含量[8，9]。研究表明，稱重法中蒸餾提取、溶劑揮發(fā)、物質(zhì)干燥、稱重等操作過程耗時(shí)較長，并易在操作中引入測量誤差。

紫外分光光度法被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)的定量分析，在植物揮發(fā)油定量分析工作中已有應(yīng)用[10，11];相較于其他檢測方法如GC-MS等，其優(yōu)勢在于無需昂貴的儀器設(shè)備，且具有操作簡單、高效和低成本等特點(diǎn)。揮發(fā)油中含有許多萜烯類物質(zhì)，大多具有吸收紫外光的特性;但將此特性應(yīng)用于烤煙的初烤煙葉揮發(fā)油含量測定上尚鮮見報(bào)道。本研究通過測定不同濃度烤煙揮發(fā)油溶液的紫外光吸收光譜，比較篩選出適用于測定烤煙揮發(fā)油濃度或含量的最佳工作波長，以此建立擬合度高的線性工作曲線，旨在為建立烤煙揮發(fā)油快速、準(zhǔn)確的定量分析方法提供參考，為分析煙葉品質(zhì)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙葉材料：烤煙品種云煙87的初烤煙葉（C3F）。

試劑：無水硫酸鈉、二氯甲烷、氯化鈉（AR，成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

雙熱源同時(shí)蒸餾萃取器;JJ124BC型電子天平（感量0.000 1 g，深圳市朗普電子科技有限公司）;DHG-9246型烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備 將煙葉置于40 ℃烘箱內(nèi)烘5～6 h后去梗粉碎，過60目篩后置于密封袋內(nèi)保存。

1.3.2 烤煙揮發(fā)油的提取 采用同時(shí)蒸餾萃取法提取烤煙揮發(fā)油[12]，向同時(shí)蒸餾萃取裝置的蒸餾大燒瓶（500 mL）中加入10 g樣品、150 mL去離子水和20 g氯化鈉，在萃取液富集端的小燒瓶（100 mL）中加入25 mL二氯甲烷;用兩個(gè)熱源同時(shí)加熱大、小兩只燒瓶，并保持二者微沸狀態(tài)3 h;經(jīng)冷卻后將溶有烤煙揮發(fā)油的二氯甲烷回收液倒入三角瓶（100 mL）中，加入5 g 無水硫酸鈉以除去其中的水分;經(jīng)過濾去除硫酸鈉晶體后將二氯甲烷回收液定容至100 mL，作為烤煙揮發(fā)油溶液的母液。

準(zhǔn)確移取一定體積V1（30～40 mL）的揮發(fā)油母液，注入已知恒定重量（m1）、容積為50 mL的試管中，將試管置于30 ℃環(huán)境中自然通風(fēng)24 h以上，待二氯甲烷揮發(fā)完全后準(zhǔn)確稱得裝有濃縮揮發(fā)油的試管總重量（m2）。烤煙揮發(fā)油母液濃度C0=（m2- m1）/ V1。

1.3.3 紫外光譜分析 經(jīng)計(jì)算后取適量的母液，并以二氯甲烷作稀釋溶劑，分別配制出濃度為母液濃度（C0）的10%、20%、40%、60%和80%的5個(gè)梯度溶液各10 mL。以二氯甲烷作為空白，用UV-2450型紫外可見分光光度計(jì)掃描后得到各梯度溶液和母液的紫外吸收光譜。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 用Excel軟件處理數(shù)據(jù)，以揮發(fā)油梯度溶液的吸光度為因變量、揮發(fā)油溶液的濃度為自變量進(jìn)行線性回歸分析，繪制烤煙揮發(fā)油溶液濃度定量分析的工作曲線，并進(jìn)行回歸模型誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烤煙揮發(fā)油溶液的紫外光譜

烤煙揮發(fā)油中含有大量能吸收紫外光的成分，如萜類、烯類等，其在紫外光譜中必然出現(xiàn)吸收峰[13]。為了解烤煙揮發(fā)油溶液的紫外吸收光譜情況，經(jīng)掃描得到了6個(gè)不同濃度的烤煙揮發(fā)油溶液在200～400 nm的紫外吸收光譜，結(jié)果如圖1所示。不同濃度的烤煙揮發(fā)油溶液紫外吸收光譜中都只有1個(gè)明顯的吸收帶，且都在225～245 nm范圍內(nèi);隨著揮發(fā)油溶液濃度的增加，各梯度溶液吸收峰值相應(yīng)增大;但最大吸收峰的波長所在位置卻并不固定，而是隨溶液濃度的增大，最大吸收峰的波長表現(xiàn)出明顯的波長增大現(xiàn)象（即發(fā)生紅移）。

2.2 工作波長的選擇

通常采用分光光度法進(jìn)行物質(zhì)定量分析時(shí)是以待測物的最大吸收波長作為工作波長，并以被測物含量（濃度）為自變量、最大的吸收波長的吸光度為因變量，從而建立計(jì)算被測物含量（濃度）的回歸模型[14]。本研究中6個(gè)不同濃度的烤煙揮發(fā)油溶液在225～245 nm的吸光度及最大吸收波長變動的情況見表1所示。隨著烤煙揮發(fā)油梯度溶液由母液濃度（C0）的10%逐漸增大到100%，6個(gè)溶液的最大紫外吸收波長也由230 nm逐漸增大、最后移動到233 nm處。鑒于最大吸收波長的不穩(wěn)定狀態(tài)不宜將其作為工作波長。有研究表明，可以利用非最大吸收波長處的吸光度建立待測物質(zhì)的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線[15]?；貧w方程的決定系數(shù)（R2）反映了回歸方程對各觀測點(diǎn)擬合程度，R2越高擬合度越好[16];根據(jù)擬合線性方程的R2高低可篩選出最佳工作波長。為探索最大波長以外是否有恰當(dāng)?shù)牟ㄩL位置可以選為工作波長，本研究求出了烤煙揮發(fā)油梯度溶液與其在225～245 nm每個(gè)波長下吸光度的線性回歸方程決定系數(shù)，結(jié)果見表1。在236～241 nm范圍內(nèi)二者的線性回歸方程決定系數(shù)都在0.999以上;其中239 nm處的吸光度與其濃度間的線性回歸方程決定系數(shù)最高，達(dá)到0.999 29，可見烤煙揮發(fā)油溶液在239 nm處的吸光度的變化最能準(zhǔn)確地反映其濃度，從而確定239 nm為最佳工作波長。

2.3 重復(fù)性分析

為檢測不同濃度的烤煙揮發(fā)油溶液在239 nm處吸光度的重復(fù)性，測定了其在239 nm處的吸光度，每個(gè)梯度溶液的樣品被重復(fù)測6次。結(jié)果表明，不同濃度梯度溶液吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均較小，為0.079%～0.468%（表2）;說明不同濃度的烤煙揮發(fā)油溶液在239 nm處吸光度有較好的重復(fù)性。

2.4 定量工作曲線的建立

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